艾恒玲 苗慧 赵欢 陈佳权 (牡丹江医学院附属第二医院妇产科,黑龙江 牡丹江 157000)
宫颈癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤,靶向治疗是其治疗方式之一〔1〕。micoRNA(miRNA)在细胞的增殖、分化和凋亡过程中发挥着重要功能,且大量研究证实miRNAs在宫颈癌的转移和分化中扮演重要角色,可用作宫颈癌靶向治疗的靶标〔2〕。研究发现miR-105在胃癌组织中明显高表达,促进胃癌细胞增殖,增强其细胞活力、迁移能力,抑制其凋亡〔3〕。miR-105过表达能促进肝癌细胞G0/G1期阻滞,抑制肝癌细胞增殖〔4〕。在筛选差异表达miRNA时发现miR-105-5p在宫颈癌细胞中上调表达〔5〕,但其对宫颈癌细胞迁移、侵袭等生物行为的影响及其机制目前还不清楚。XAF1是促凋亡的肿瘤抑制因子,拮抗X-连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)抗细胞凋亡作用的蛋白,在多种人类癌症中失活或下调表达,过表达XAF1可诱导凋亡、抑制增殖〔6〕。XAF1在宫颈癌组织中下调表达,促进其表达会抑制宫颈癌发生及发展过程〔7〕。本文旨在研究miR-105-5p对宫颈癌细胞迁移和侵袭的影响及其机制是否与XAF1有关。
1.1材料 宫颈癌细胞HeLa、SiHa和正常宫颈细胞Ect1/E6E7购自中国科学院上海细胞库;RPMI1640培养基购自美国Gibico公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京Solarbio公司;荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司;Transwell小室、Matrigel购于美国BD公司;RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养与分组 宫颈癌细胞HeLa、SiHa和正常宫颈细胞Ect1/E6E7使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基;取对数生长期细胞HeLa,将其分为miR-NC组(转染miR-NC)、miR-105a-5p组(转染miR-105a-5p mimics)、anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、anti-miR-105a-5p组(转染anti-miR-105a-5p)、pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1)、pcDNA3.1-XAF1组(转染pcDNA3.1-XAF1)、anti-miR-105a-5p+si-NC组(共转染anti-miR-105a-5p和si-NC)、anti-miR-105a-5p+ si-XAF1组(共转染anti-miR-105a-5p和si-XAF1)。
1.2.2qRT-PCR检测miR-105a-5p和XAF1 mRNA表达水平 提取细胞总RNA,反转录成cDNA,按照试剂盒说明配制反应体系,进行PCR扩增,相对表达量采用2-△△Ct法计算。
1.2.3Western印迹检测蛋白的表达 提取总蛋白,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,用脱脂奶粉封闭后,分别加入一抗和二抗孵育,然后进行显影、定影,检测蛋白条带灰度值,以目的条带和GAPDH条带的比值作为蛋白表达水平。
1.2.4Transwell检测细胞迁移和侵袭 迁移实验:Transwell小室接种细胞,下室加入含血清培养液,培养24 h,擦去上层细胞,甲醛固定、结晶紫染色10 min,显微镜观察并计数。侵袭实验:Transwell上室平铺Matrigel,其余同迁移实验。
1.2.5荧光素酶报告基因检测实验检测miR-105-5p对XAF1的靶向调控 构建野生型和突变型XAF1的3′UTR荧光素酶表达载体(WT-XAF1和MUT-XAF1),将其分别与miR-NC和miR-105-5p共转染至HeLa细胞中;依据说明书要求检测荧光素酶活性。
1.3统计学分析 采用SPSS20.00软件进行t检验,方差分析。
2.1miR-105-5p在宫颈癌细胞HeLa、SiHa和正常宫颈细胞Ect1/E6E7中的表达 与正常宫颈细胞Ect1/E6E7(0.16±0.01)相比,宫颈癌细胞HeLa、SiHa中miR-105-5p的表达水平显升高(0.89±0.09、0.42±0.04,F=251.449,P=0.000)。
2.2抑制miR-105-5p表达对宫颈癌细胞迁移、侵袭的影响 与anti-miR-NC组相比,anti-miR-105a-5p组宫颈癌细胞迁移和侵袭数量显著降低,MMP-2蛋白的表达水平显著降低,E-cadherin蛋白的表达水平显著升高(P<0.05),见图1,表1。
图1 抑制miR-105-5p表达对宫颈癌细胞迁移、侵袭蛋白表达的影响
2.3miR-105-5p靶向、调控XAF1 TargetScan数据库预测显示XAF1与miR-105-5p存在结合位点(图2)。miR-105-5p与WT-XAF1转染后的细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05);miR-105-5p与MUT-XAF1转染后的细胞荧光素酶活性差异不显著,见表2。与miR-NC组比较,miR-105-5p组XAF1表达水平显著降低,与anti-NC组比较,anti-miR-105-5p组XAF1表达水平显著升高(P<0.05),见图3,表3。
图2 Western印迹检测XAF1的3′UTR含有miR-105-5p的互补序列
表2 双荧光素酶报告实验
1~4:MiR-NC组、miR-105a-5p组、anti-miR-NC组、anti-miR-105a-5p组图3 Western印迹检测XAF1蛋白的表达
表3 miR-105a-5p调控XAF1的表达
2.4过表达XAF1对宫颈癌细胞迁移、侵袭的影响 与pcDNA3.1组相比,pcDNA3.1-XAF1组宫颈癌细胞迁移和侵袭数量显著降低(P<0.05),MMP-2蛋白表达水平显著降低,XAF1和E-cadherin蛋白表达水平显著升高(P<0.05),见表4,图4。
图4 过表达XAF1对宫颈癌细胞蛋白表达的影响
2.5抑制XAF1表达能逆转抑制miR-105-5p表达对宫颈癌细胞迁移、侵袭的作用 与anti-miR-NC组比较,anti-miR-105a-5p组宫颈癌细胞迁移和侵袭数量显著降低,MMP-2蛋白表达显著降低,XAF1和E-cadherin蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与anti-miR-105a-5p+si-NC组相比,anti-miR-105a-5p+ si-XAF1组宫颈癌细胞迁移和侵袭数量显著升高,MMP-2蛋白表达水平显著升高,XAF1和E-cadherin蛋白表达水平显著降低(P<0.05),见图5,表5。
1~4:Anti-miR-NC组、anti-miR-105a-5p组、anti-miR-105a-5p+si-NC组、atin-miR-105a-5p+si-XAF1组图5 抑制XAF1表达能逆转抑制miR-105-5p表达对宫颈癌细胞迁移、侵袭蛋白表达的影响
宫颈癌是仅次于乳腺癌的第二大女性恶性肿瘤,虽然手术、放化疗等治疗方式已延长患者的生存时间,改善患者的生存质量,但临床上对于晚期和复发型宫颈癌的治疗仍较为棘手分子水平上的靶向治疗可达到提高疗效、减少毒副作用的目的〔8〕。研究发现miRNA影响宫颈癌的进展,研究miRNA有利于宫颈癌的早期诊断治疗及预后评估〔9〕。miR-105通过MYC依赖的基质细胞代谢促进肿瘤生长〔10〕;miR-105通过下调SFRP1激活Wnt/β-连环蛋白信号传导,从而促进三阴性乳腺癌细胞的干性,化学抗性和转移〔11〕。miR-105在结直肠癌中的上调与侵袭性表型相关,miR-105表达参与TNF-α诱导的上皮-间质转化(EMT)〔12〕。miR-105的表达在胃癌组织中降低,miR-105的过表达抑制胃癌细胞增殖和进展〔13〕。在本实验中,miR-105a-5p在宫颈癌细胞中表达升高,抑制miR-105a-5p表达可抑制宫颈癌细胞迁移和侵袭,抑制MMP-2蛋白的表达,促进E-cadherin蛋白的表达。
XAF1是一种抑癌基因,是XIAP最强的抑制因子,参与多种肿瘤的进展。研究其在肿瘤中的作用机制,对相关癌症的治疗具有重要意义,可作为分子靶向治疗的靶点。研究发现XAF1非小细胞肺癌中下调表达〔14〕;XAF1在口腔鳞癌组织中低表达,过表达XAF1抑制口腔鳞状细胞癌细胞的生长,促进细胞凋亡〔15〕;Xaf1抑制表达会抑制结肠癌细胞凋亡〔16〕。XAF1与IRF-1形成正反馈环,增加了应激诱导的细胞凋亡并降低了肿瘤细胞的侵袭能力〔16〕。沉默HS6ST3通过诱导XAF1来抑制乳腺癌细胞的生长和进展〔17〕。内毒素刺激的巨噬细胞产生大量IFNβ,而IFNβ通过增加XAF1的表达诱导胰腺β细胞凋亡〔18〕。XAF1在宫颈上皮内瘤变及宫颈癌组织中低表达,与宫颈鳞癌癌变相关〔19〕。本实验结果表明过表达XAF1可抑制宫颈癌细胞迁移和侵袭,抑制MMP-2蛋白的表达,促进E-cadherin蛋白的表达。且miR-105a-5p靶向负调控XAF1,抑制XAF1表达逆转了抑制miR-105a-5p对宫颈癌细胞迁移和侵袭的抑制作用。
综上所述,抑制miR-105a-5p表达可能通上调XAF1抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭。