硫化氢通过调控JNK通路改善H型高血压大鼠心肌纤维化

李亚灵 刘茂军 郑霞 易嘉莉 宋熊 刘达 王森 杨军

(南华大学附属第一医院心血管内科，湖南 衡阳 421000)

高血压是引起全球发病率和死亡率升高的主要原因之一，长期处于压力超负荷状态下可导致心肌细胞肥大、凋亡、心肌纤维化，最终诱发心肌重构和心力衰竭〔1〕。我国大约有75%高血压患者同时合并高同型半胱氨酸血症(HHCY)(血浆HHCY≥10 μmol/L)。原发性高血压伴HHCY血症通常被称为“H型高血压”，目前已发现H型高血压患者心肌纤维化发生率与普通高血压患者相比明显升高〔2〕，但对其具体机制尚不明确。c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路可参与心肌纤维化的发生发展机制，并与诱导细胞凋亡有关〔3〕。新近发现的第三种气体信号分子H2S已被证实其可通过抗炎、抗氧化、抗凋亡的机制，发挥保护心血管的作用〔4〕，但对其是否能改善H型高血压导致的心肌纤维化仍不是十分清楚。本文拟建立H型高血压大鼠模型，观察H2S对H型高血压大鼠心肌纤维化的影响，并探讨其机制是否与JNK信号通路，细胞凋亡有关。

1 材料与方法

1.1实验动物 30只雄性自发性高血压(SHR)大鼠和20只同品系正常血压对照成年雄性京都种(WKY)大鼠，均购于北京维通利华实验动物技术有限公司，重(200±20)g，于(24±3)℃温度的室内饲养，自由取食及饮水，每12 h昼夜交替一次。

1.2实验试剂 兔源JNK、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-9等一抗及抗兔二抗均购于Proteintech公司(美国)，兔源GAPDH购于博士德公司(中国)；硫氢化钠(NaHS)购于Sigma 公司(美国);茴香霉素(Anisomycin)和L-蛋氨酸等购于美仑生物公司(中国)；细胞裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒购于碧云天公司(中国)。

1.3模型制备 将SHR大鼠和WKY大鼠适应性喂养1 w后，其中 30只SHR大鼠饮用1%L-蛋氨酸建立H型高血压模型后〔5,6〕随机分为Model组10只，Model+H2S组10只，Anisomycin组10只。另20只WKY大鼠同样条件普通饮水后随机分为Control组10只，Control+H2S组10只。此外，Model+H2S组、Anisomycin组及Control+H2S组大鼠均给予NaHS〔56 μmol/(kg·d)〕腹腔注射，Anisomycin组大鼠在腹腔注射NaHS基础上增加JNK的激动剂Anisomycin〔5 mg/(kg·d)〕腹腔注射。Control组和Model组大鼠均使用同等剂量的生理盐水腹腔注射，持续4 w。

1.4Masson 染色观察心脏组织纤维化程度 取出固定于甲醛的心肌组织标本，石蜡包埋，再脱水制成4 μm切片标本，按Masson试剂盒进行染色，光镜下观察心肌组织胶原纤维情况。

1.5Western印迹检测心肌组织中JNK、Bcl2、Caspase-9蛋白的表达 在含有裂解液的缓冲液中提取总蛋白，然后使用 BCA 蛋白分析试剂盒定量。蛋白质变性后，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，并通过湿转移法转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在室温下用含 5% 脱脂奶的 Tween-20 缓冲液(TBST)封闭 2 h。膜用含有一抗的封闭液孵育过夜(配比为：抗体GAPDH、Bcl2、Caspase-9,均为1∶1 000)，用TBST洗3次膜后，继续孵育二抗(1∶5 000)室温 1 h。接下来，膜在 TBST 缓冲液中清洗3次。最后，使用分子成像仪系统分析条带。

1.6统计学方法 运用SPSS18.0软件进行Student-t检验单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组大鼠心肌胶原的变化 Masson染色中镜下观察胶原纤维呈蓝色。Model组、Anisomycin组大鼠肌丝排列不整齐，胶原纤维与Control组相比明显增加(P<0.05)；Model+H2S组经H2S供体干预后胶原沉积明显减少(P<0.05)；H2S 组胶原沉积较Control组无明显变化(P>0.05)。见图1。

图1 H2S对大鼠心肌纤维化沉积的影响(Masson染色，×400)

2.2各组大鼠心肌组织中Bcl2、Caspase-9相关凋亡蛋白的表达水平 与Control组比较，Model组、Anisomycin组大鼠心肌组织中Caspase-9蛋白表达水平明显上调 (P<0.05)；Bcl2蛋白表达水平明显下调(P<0.05)；与Model组比较，Model+H2S组，大鼠心肌组织中Caspase-9蛋白表达水平明显下调(P<0.05)；Bcl2蛋白表达水平明显上调 (P<0.05)。H2S组和Control组大鼠心肌组织中Bcl2、Caspase-9蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图2，表1。

1～5：Control组、Model组、Model+H2S组、Anisomycin组、H2S组，下图同图2 各组心肌组织中Bcl2、Caspase-9的表达水平

2.3各组大鼠心肌组织中JNK相关通路蛋白表达水平 与Control组比较，Model组、Anisomycin组大鼠心肌组织中JNK蛋白表达水平明显上调(P<0.05)；与Model组比较，Model+H2S组，大鼠心肌组织中JNK蛋白表达水平明显下调(P<0.05)；H2S组和Control组大鼠心肌组织中JNK蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图3，表1。

图3 各组心肌组织中JNK的表达水平

表1 各组心肌组织中Bcl2、Caspase-9、JNK蛋白表达比较

3 讨 论

研究报道，高血压可导致心室僵硬度增加和心肌纤维化，诱发心肌重构和心功能下降〔7〕，最终引发心血管死亡事件。在我国，75%高血压人群合并HHCY血症，有研究发现〔8〕，HCY可通过激活基质金属蛋白酶(MMP)-2诱发心肌纤维化，同时也有报道指出〔9〕，高HCY会加速压力超负荷下心肌纤维化的进展，导致心力衰竭等不良心血管事件的发生。本研究结果提示H型高血压可导致明显心肌纤维化。心肌纤维化是指心脏间质重塑，并以心肌间质成纤维细胞的过度增殖和胶原过度沉积为主要特征。Takemura等〔10〕发现细胞凋亡与梗死后心肌重构和心力衰竭密切相关。Yu等〔11〕也有类似发现，同样该机制在其他心肌重构模型中也得到证实。本研究结果提示细胞凋亡可能参与H型高血压心肌纤维化的发生机制。

JNK是三种促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的成员之一，参与细胞凋亡的调控机制〔12〕。Qi等〔13〕通过心肌缺血/再灌注模型发现JNK激活可通过下调Bcl2促进细胞凋亡，也有研究证实〔14〕转化生长因子(TGF)-β1可通过激活p38 MAPK-JNK-Caspase-9/8/3途径诱导了细胞凋亡。本研究结果提示JNK信号通路的激活可能参与H型高血压大鼠心肌细胞凋亡的调控机制。

作为第三种气体信号分子，H2S已被证实可通过抗炎、抗凋亡、抗氧化的机制发挥保护心血管的作用〔14〕。已有研究证实H2S可改善高血压诱导下心力衰竭小鼠的左心室重构，并且能改善HHCYH9C2心肌细胞中MMPs失衡〔8〕。本研究结果提示H2S可通过激活JNK信号通路抑制细胞凋亡，进而改善H型高血压大鼠心肌纤维化，但对其具体分子机制仍需进一步研究探讨。