云南杂交玉米SSR标记核心引物的筛选及多样性分析

姚宗泽 杨肖艳 张艳明 段 忠 赵自仙

(1云南农业大学农学与生物技术学院，云南 昆明 650201；2大理白族自治州农业科学推广研究院，云南 大理 671005；3云南省绿色食品发展中心，云南 昆明 650224)

简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)也称为微卫星标记，由2～5 个核苷酸为重复单位串联组成，广泛分布在整个真核生物基因组中。同一种植物中，在各个位点上重复单位的数量也不完全相同，从而形成了多态性，即SSR 分子标记[1]。大量研究表明，除在个别作物中SSR 位点等位基因数目不多外，很多作物中均表现出较高的多态性，一个SSR 位点等位基因数目最多可达几十个[2-3]。不同作物品种的遗传组成不同，使得基因组DNA 中SSR 的重复次数也存在差异，这种差异可先通过PCR 扩增，再借助琼脂糖凝胶电泳或聚丙稀酸胺凝胶电泳等技术检测到SSR[4]。

根据重复单位碱基数可将SSR 分为1～6 核苷酸重复类型[5]，所有类型的微卫星中，单核苷酸重复和二核苷酸重复的微卫星在基因组中出现的频率最高。同一重复类型中，不同的碱基重复多态性也不一致。大豆中大于15 个重复单位的(GA)n的多态性较低，而较多的(AT)n重复的SSR 具有较高的多态性信息量[6]。Weber[7]按照微卫星核心序列结构的不同将微卫星标记分为三种类型:完全型(perfect)、不完全型(imperfect)和复合型(compound)。与其他分子标记技术相比，SSR 技术具有多态性高、呈共显性、对DNA 数量及质量要求不高、操作简单、成本低等优点[4]。

相关研究报道比较了DNA 指纹技术在植物新品种判定中的可行性，表明DNA 指纹技术的鉴定结果客观可靠[8-12]。SSR 标记已广泛应用于玉米、水稻、马铃薯、番茄、棉花和麦类等作物的遗传作图、遗传标记、DNA 指纹图谱、品种鉴定、遗传多样性以及遗传分化等方面的研究[13-16]。刘文彬等[17]筛选出多态性高、稳定性好、适用于自动化分型(荧光毛细管电泳)的9对SSR 引物。胡萍等[18]为构建玉米种质DNA 指纹库，分别筛选出作贵州普通玉米和贵州糯玉米的SSR核心引物23 对和15 对。韩凤龙[19]筛选得到6 个SSR标记，适用于河南小麦品种特异性和一致性鉴定。SSR 标记应用于大豆(Glycine max)[20]、油菜(Brassica campestrisL.)[21]、玉米(Zea mays)[22-23]、番茄(Solanum lyooper)等[24]作物的特异性、一致性、稳定性(distinetness，uniformity，stability，DUS)检测在日益增加。在Maize database 网站上公布的SSR 引物已有1 800 多种，但真正具有利用价值的引物较少，只有那些多态性高、带型清晰稳定和重复性好的引物才能被有效应用[25]。玉米品种SSR 标记鉴定技术规程，推荐了40 对SSR 引物用于品种鉴定，本研究对这40 对引物进行进一步筛选，旨在选出可用于云南玉米杂交种特异性鉴定使用的核心引物，从而降低引物合成成本，加快鉴定程序。

1 材料与方法

1.1 材料

试验涉及的220 个杂交玉米品种材料见表1，其中113 个购自云南市场，23 个为云南种业集团联合体提供的2017—2018年区试品种，33 个为未审定玉米新组配，51 个为未提供品种名称的已通过云南省审定的杂交玉米品种，在本研究材料名称中暂记为未知。研究选用的40 对SSR 引物，均为玉米SSR 标记鉴定规程中推荐的引物[26]。

表1(续)

表1(续)

1.2 方法

1.2.1 材料准备 用发芽盒在光照培养箱中培育玉米幼苗，每个品种30 粒，以每天16 h 黑暗/25℃、8 h光照/30℃条件培养6 d，即可取样提基因组DNA。每个材料剪取20 片相等叶面积的幼苗叶片，每株幼苗取1 片，剪碎充分混合，再取样提取基因组DNA。

1.2.2 基因组DNA 提取 取约250 mg 叶片，基因组DNA 提取具体步骤参照Saghai-Maroof 等的[27]方法，以100 μL 超纯水充分溶解基因组DNA。用琼脂糖电泳对提取DNA 质量进行检测。

1.2.3 PCR 扩增及普通非变性PAGE PCR 反应体系为20 μL，包括Green Taq Mix 12.0 μL、正反向引物合1.0 μL、DNA 1.0 μL，ddH2O 6.0 μL，整个操作过程均在冰上完成。PCR 反应程序:94℃预变性5 min，1次循环；94℃变性40 s，57～61℃退火35 s，72℃延伸45 s，35 次循环；72℃，7 min。待PCR 扩增完成后，用0.8%琼脂糖凝胶电泳对PCR 扩增产物进行检测。

普通非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegegel gel electrophoresis，PAGE)参照玉米SSR 标记鉴定规程中的要求进行[26]。

1.2.4 引物筛选 试验先以表1中编号V001-V012杂交玉米品种为材料，从40 对标准SSR 引物中筛选出20 对多态性高、扩增条带清晰、稳定性好的引物，作为SSR 标记分析核心引物。并以表1中的220 个杂交玉米为材料，对所筛选的20 个SSR 核心引物作进一步分析评价。

1.2.5 SSR 遗传多样性分析 采用Shannon-Weaver多样性指数为指标[28]，利用PopGen32 软件分析不同SSR 标记的多样性大小。Shannon-Weaver 多样性信息指数(H′)的计算公式为:

式中，Pi为某个SSR 标记位点中第i个等位基因出现的频率，i≤Na，Na 为SSR 标记的等位变异数目。Ne 为有效等位变异数[29-30]，其计算公式如下:

1.2.6 聚类分析 根据220 个杂交玉米材料的基因类型，利用NTSYSpc2.10e 统计软件中similarity 程序计算相似系数，以Clustering 程序中SHAN 进行UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean，非加权组平均法)聚类分析[28]获得品种间的相似系数。并用MEGA6 软件中Phylogeny 绘制各玉米品种的遗传聚类系统树。

2 结果与分析

2.1 DNA 检测结果

用1%琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA 样品质量进行检测，如图1所示，DNA 条带明亮、清晰完整、拖尾不明显。说明所提取的DNA 纯度好、质量高，杂质含量较少，可用于后续试验。

2.2 核心引物筛选结果

用12 个杂交玉米品种对40 个SSR 引物进行筛选，结果如表2所示，40 对引物中每对引物扩增出6～15 个等位变异位点，共检测到412 个等位基因，平均每对引物检测到10.30 个；具有多态性位点有4～15个，平均每对引物检测到多态性位点9.40 个；多态性位点百分率为50.00%～100.00%，平均每对引物多态性位点百分率为90.53%。有7 对引物扩增条带效果较好，16 对引物扩增效果为好，11 对引物扩增效果差，6 对引物扩增效果较差(图2)。

综合考虑引物多态性及扩增效果，筛选出20 对引物，引物编号分别为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P11、P12、P13、P15、P17、P19、P21、P22、P24、P25、P28、P33，推荐其作为核心引物，在SSR 标记鉴定云南杂交玉米品种时优先使用。通过分析，20 对核心引物在12 个杂交玉米品种中共检测到216 个等位基因，20对核心引物检测到的等位基因占总数的52.43%，平均每对引物检测到10.80 个，变幅为7～15 个；具有多态性位点有4～14 个，平均每对引物检测到多态性位点9.70 个；多态性位点百分率为50.00%～100.00%，平均每对引物多态性位点百分率为88.66%。

表2 40 对SSR 引物扩增结果Table 2 Amplification results for 40 pairs of SSR primer

2.3 杂交玉米材料SSR 遗传多样性分析

利用PopGen32 软件分析220 个杂交玉米材料中20 个标记的等位变异数(Na)、有效等位变异数(Ne)和Shannon-Weaver 多样性信息指数(H′)。由表3可知，20 对SSR 核心引物在220 个杂交玉米材料中共检测到236 个等位变异，平均每个引物检测到11.80 个，变幅为7～17 个；平均有效等位变异为3.158 8，变幅为1.241 3～5.671 1；平均Shannon-Weaver 多样性信息指数为3.028 2，变幅为1.426 2～4.813 9。

2.4 杂交玉米材料聚类分析

采用UPGMA 法对220 个杂交玉米材料进行聚类分析，结果表明220 个杂交玉米材料间的相似系数为0.62～0.95，聚类结果如图3所示。以最低相似系数0.62 为阈值可将220 个杂交玉米材料划分为两大类群，其中第Ⅰ类群共有10 个杂交玉米材料，占4.5%；第Ⅱ类群共有210 个杂交玉米材料，占95.5%。第Ⅰ类群的10 个杂交玉米材料均为区试品种，表明该10个区试品种的亲本较其他亲本亲缘关系更远，具有一定的创新性。聚类结果显示，良禾668(V198)与宣瑞4 号(V218)的相似系数最高，为0.95；V187 与胜玉607(V204)的相似系数最低，为0.62。220 个杂交玉米材料均为在云南各地区种植的品种和试验示范的材料，从聚类图可看出，220 个杂交玉米材料间最高相似系数达到0.95，但未出现同时有几个材料聚集在一起的情况，说明本研究所选的材料来源广泛，具有代表性，研究结果具有一定的科学依据和参考价值。

3 讨论

3.1 SSR 核心引物筛选

筛选的20 对SSR 核心引物，在12 个杂交玉米品种中共检测到216 个等位基因，平均每对引物检测到10.80 个，变幅为7～15。在220 个杂交玉米材料中共检测到236 个等位变异，平均每个引物检测到11.80个，变幅为7～17；平均有效等位变异为3.15 88，变幅为1.241 3～5.671 1；平均Shannon-Weaver 多样性信息指数为3.028 2，变幅为1.426 2～4.813 9。从两组杂交玉米材料的鉴定分析结果可知，两组数据比较接近，说明该20 对SSR 引物扩增结果比较稳定、重复性好。20 对SSR 核心引物分布在9 条染色体上，覆盖90%的玉米染色体组。20 对核心引物在玉米5 号染色体上未分布，在其他染色体上均有分布。可能是由于在玉米5 号染色体上SSR 较少或者多态性低，也有可能是玉米品种SSR 标记鉴定技术规程中推荐的40对标准引物，并不适用于5 号染色体中SSR 的扩增。SSR 在个别作物中存在较少，但广泛分布在玉米[31]、水稻[32]、大麦[33]等作物中。故推断这20 对SSR 引物适合用于云南杂交玉米品种的特异性鉴定，推荐其作为核心引物，在云南玉米杂交种特异性鉴定时优先使用。

核心引物的确定是SSR 标记鉴定的重要组成部分，不仅大大降低了引物合成的成本，而且还可减少很多不必要的工作[34]。如果统一使用一套核心引物，可以比较与整合来自不同研究单位的不同材料的指纹结果，促进资源共享。Li 等[35]推荐了13 对多态性较高的核心SSR 引物，认为13 对核心引物非常适合用于陆地棉、海岛棉和亚洲棉的鉴定和DNA 指纹图谱构建，减少SSR 引物数量，降低成本。

表3 20 对SSR 标记在220 个杂交玉米材料中的多样性参数Table 3 Diversity parameters of 20 pairs of SSR markers in 220 maize hybrid materials

3.2 220 个杂交玉米材料多样性分析

220 个杂交玉米材料间的相似系数为0.62～0.95，以0.62 为阈值可将材料分为两大类群，第Ⅰ类群包括10 个玉米材料，第Ⅱ类群包含210 个玉米材料。第Ⅰ类群的10 个杂交玉米材料均为区试品种，表明该10 个区试品种的亲本较其他亲本亲缘关系更远。聚类结果显示，良禾668(V198)与宣瑞4 号(V218)的相似系数最高，为0.95；V187 与胜玉607(V204)的相似系数最低，为0.62。尽管有一些杂交玉米材料与其他材料之间存在一定的遗传差异，但整体差异不大。本研究的220 个杂交玉米材料中不仅包括一些正在区试的杂交玉米品种，还有已经在市场上推广的杂交玉米品种，说明当前培育的杂交玉米品种，与其他作物存在同样的问题，在基因型上存在同质化趋势，导致很多品种在表型上没有区别[36]。导致品种同质化的原因，可能是核心亲本的集中使用，也有可能是核心亲本之间亲缘关系较近。突破这一瓶颈，势必要加强基础材料收集、研究与创新[37]。拓宽基础材料，选择来源和生态差异较大的材料，充分发挥现代生物技术在农作物新品种培育过程中的作用[38-39]，将有可能培育出综合性状优良，且超越当前主推品种的新品种。

4 结论

本研究从玉米SSR 标记鉴定规程推荐的40 对SSR 引物中筛选出多态性高、扩增效果好、稳定性好的20 对引物，推荐其作为核心引物，在云南玉米杂交种特异性鉴定时优先使用。