基于EST-SSR标记的MCID法鉴定冬瓜种质资源

叶新如 刘建汀 李永平 朱海生 温庆放

(1福建省蔬菜遗传育种重点实验室，福建 福州 350013；2福建省农业科学院作物研究所/福建省农业科学院蔬菜研究中心，福建 福州 350013)

冬瓜属于葫芦科(Cucurbitaceae) 冬瓜属(Benincasa Savi)一年生蔓性草本植物。冬瓜是我国传统种植的蔬菜品种，已有2 000 多年的栽培历史[1]。冬瓜中富含氨基酸、维生素C、酚类等活性物质，兼具药用和保健功能，经济价值较高。冬瓜最初起源于中国南部、东南亚及印度等国家[2-3]。现阶段，我国国家种质资源库收集保存冬瓜资源300 余份，其中大部分为我国地方品种[4]。冬瓜育种方式主要是常规杂交育种，在杂交组合配制过程中随机性高、品种间遗传基础狭窄，导致出现杂种优势不明显等问题，大大影响育种效率。我国冬瓜资源较为丰富，常出现各地域间相互引种栽培、育种，并各自命名的现象[4-6]，也容易出现同物异名或同名异物的问题。因此，利用DNA 分子标记系统地鉴定和评价冬瓜种质资源具有重要意义。

DNA 分子标记技术以个体间核苷酸序列差异为基础，在DNA 水平上直接反映遗传变异的标记，具有精确度高、不受外界环境影响等优点，并广泛应用于作物分子辅助育种、品种鉴定、遗传多样性分析等方面[7-10]。目前常用的DNA 标记技术有核苷酸重复序列(simple sequence repeat，SSR)、限制性片段多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、序列相关扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)等[11-14]。SSR 是一类由几个碱基组成的基因序列串联重复而成的DNA 序列。根据来源不同，SSR 分为基因组SSR 和植物表达序列标签SSR(expressed sequence tags SSR，EST-SSR)。ESTSSR 标记是以PCR 技术为关键，直接从获得的EST 序列中筛选SSR。因此，EST-SSR 除了具有基因组SSR 的共显性遗传、分布趋势随机、多态性强等优点外，其通用性和保守性较基因组SSR 高[15]，已广泛应用于水稻(Oryza satiraL.)[16]、黄皮(Clausena lansium)[17]、南瓜(Cucurbiha maxima)[18]、铁皮石斛(Dendrobium officinale)[19]等多种作物的SSR 分子标记开发。

人工绘制品种鉴别示意图(manual cultivar identification diagram，MCID)法是基于DNA 分子标记快速鉴定品种的一种方法。MCID 法可以根据特异性引物和PCR 扩增后的特征性谱带直观地显示出鉴别过程，绘制不同品种间的图谱关系[20]，目前已在葡萄(Vitis viniferaL.)[21]、柿子(Diospyros kaki)[22]、萝卜(Raphanus sativusL.)[23]、青花菜(Brassica oleracevar italica)[24]等作物上成功应用。但有关冬瓜的MCID法研究尚鲜见报道。本研究利用组前期转录组测序结果[25]，挖掘EST-SSR 引物，最终共筛选出7 对SSR 引物，对40 份冬瓜种质资源进行PCR 扩增，利用全自动核酸蛋白分析仪检测扩增产物，分析冬瓜资源遗传多样性并构建品种鉴别示意图(cultivar identification diagram，CID)图谱，以期从分子水平上对冬瓜种质资源的鉴定和新品种选育提供科学依据和参考数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究以40 份冬瓜资源的嫩叶为材料(表1)，利用Illumina HiSeqTM2000 测序平台进行转录组测序。冬瓜嫩叶采自福建省农业科学院作物研究所福清市东张镇蔬菜科研基地，测序由广州基迪奥生物有限公司完成。

1.2 DNA 提取

利用CTAB 法[26]提取冬瓜叶片基因组DNA，分别采用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳和NanoDropND-2000 超微量蛋白核酸测定仪(Eppendorf 公司，德国)对DNA 的品质和浓度进行检测，最终将DNA 浓度稀释至50 ng·μL-1，-20℃保存备用。

1.3 冬瓜转录组SSR 鉴别及引物设计

利用MISA 软件对冬瓜转录组Unigene 进行SSR位点搜索。筛选标准:单核苷酸最少重复次数10 次；二核苷酸最少重复次数6 次；三、四、五、六核苷酸最少重复次数5 次。利用Primer 3.0 设计SSR 引物，每条SSR 产生3 组引物。

1.4 PCR 扩增与检测

利用本研究前期转录组测序结果，筛选出7 对SSR 引物对40 份冬瓜资源进行扩增。PCR 反应总体系25 μL，其中0.5 μL dNTP，0.3 μL Taq 酶，1.5 μL DNA，1 μL 引物，2.5 μL 10×Buffer(含Mg2＋)，18.2 μL ddH2O。扩增程序:94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃复性30 s，72℃延伸1 min，35 个循环；72℃延伸10 min。最终产物置于4℃冰箱保存。PCR 产物经DYY-6D 琼脂糖凝胶电泳检测(北京六一生物科技有限公司)，适合的扩增产物进一步在全自动核酸蛋白分析仪(LabChip GX Touch 24，美国PerkinElmer 公司)上检测。

表1 试验所用材料Table 1 Wax gourd cultivars used in the study

1.5 冬瓜MCID 法的建立

根据核酸蛋白分析仪的检测结果，筛选出PCR 扩增条带清晰的引物对40 份冬瓜资源进行鉴定。首先统计某一引物扩增的电泳图中，在相同的电泳迁移率处有无特征性谱带。该处具有相同扩增谱带的资源分为一组，无此谱带的归为一组。之后继续加入引物依据相同的统计方法以此逐步再进行分类，直至所有参试材料均清晰地区分开。最后，按照鉴定结果绘制CID 图谱，将所用引物和多态性谱带大小(bp)标记到CID 图谱对应位置。

1.6 冬瓜种质资源遗传多样性分析

根据所获得的电泳图谱进行分析。电泳图中的条带分别代表模板和引物之间的结合位点，根据SSR 的扩增产物计算电泳图谱上清晰可靠的条带，在同一位置出现条带的标记为“1”，没有条带的标记为“0”，根据计算出的“0”和“1”输入Excel 组成二维数据矩阵。应用Ntsys2.10e 软件进行数据处理按系统聚类进行聚类绘图[27]。

2 结果与分析

2.1 冬瓜转录组的SSR 位点分析

冬瓜转录组测序后，进行组装，获得40 604 条Unigene，对其进行SSR 位点搜索。在所有Unigene中，含1 条以上SSR 基序的Unigene 有804 条，复合型SSR 序列的Unigene 有388 条。转录组数据中主要有5 种SSR 类型，分别是二核苷酸重复到六核苷酸重复。不同SSR 序列数量相差较大，二核苷酸重复类型中，AG/CT 重复基序最多，占26.21%；其次是三核苷酸重复类型，而五核苷酸重复和六核苷酸重复类型数量较少。

冬瓜转录组SSR 重复单元次数在4～30 次，多集中于4～15 次，共有SSR 5 474 条，其中重复次数最多的是5 次(1 462 条)，占26.71%，其次是6 次(1 398，25.54%)、7 次(819，14.96%)、4 次(602，11%)，14 次重复次数最少，仅24 条。冬瓜转录组SSR 长度在12～239 bp 之间，SSR 长度是影响多态性的一个指标，具体为SSR 长度≤12 bp，多态性低；12 bp＜SSR 长度＜20 bp，多态性中等；SSR 长度≥20 bp，多态性高。在筛选引物过程中，将多态性低的SSR 排除，共得到4 471 条冬瓜SSR，SSR 长度介于12～20 bp 之间和长度大于20 bp 的数量分别为2 742 条和1 729 条。

2.2 冬瓜SSR 扩增及多态性检测

根据冬瓜转录组SSR 序列，随机合成100 对引物对40 份冬瓜资源进行PCR 扩增，最终筛选出7 对特异性较好的引物(表2)。结果表明，7 对引物扩增的条带清晰、可辨。进一步利用核酸蛋白分析仪检测，筛选出的引物可以检测出多态性核酸峰值图。图1为引物2(Y2)的检测结果，可以看出引物2 在1 号资源、2号资源、3 号资源和10 号资源中检测出的多态性片段长度分别为216 bp＋304 bp＋333 bp、216 bp＋317 bp＋346 bp、218 bp＋322 bp＋351 bp 和213 bp＋300 bp＋329 bp，多态性核酸峰值图结果清晰明确，可以将4 份资源区分开。多态性片段长度能由多态性核酸峰值图确定，应用于品种的鉴别。

2.3 冬瓜资源鉴定

根据筛选出的7 对SSR 引物，利用MCID 法对冬瓜资源进行鉴定，最终利用3 对引物可将40 份冬瓜资源逐一区分(图2)。首先根据引物16 扩增出特征性谱带将40 份冬瓜资源分为19 组，有特征性谱带的用(＋)表示，无特征性谱带的用(-)表示。第一组为281 bp(＋)和316 bp(-)，包含33 号和34 号2 份资源；含281 bp、316 bp 特征性谱带的资源被单独鉴定出来，38号为第二组；第三组为260 bp(＋)和268 bp(-)，包含4 号资源；第四组共包含6 份资源，均无206 bp 特征性谱带，含304 bp 特征谱带；第五组资源同时包含260 bp、268 bp 和304 bp 谱带，包括1、7、8、12 号4 份资源；第六组为260 bp(＋)、268 bp(＋)、304 bp(-)，包括2、3、5、6、9、10、11 号7 份资源；第七组为208 bp(＋)、275 bp(-)，含37 号资源；第八组和第九组分别为204 bp(-)、208 bp(-)、281 bp(＋)和200 bp(＋)、204 bp(＋)、275 bp(-)，39 号和40 号资源单独被鉴定出来；第十组为198 bp(-)、260 bp(-)、268 bp(＋)、304 bp(-)，包含15、19、22、27 号4 份资源；第十一组为198 bp(-)、204 bp(＋)和281 bp(＋)，31 号资源被单独鉴定出来；在198 bp 和275 bp 处含特征性谱带，281 bp处无特征性谱带的3 份资源被单独鉴定出来为第十二组；36、21 号资源分别鉴定成第十三、第十四组；第十五组在194 bp、275 bp 处有特征性谱带，而在316 bp处无特征性谱带，共包括26、29 号2 份资源；25、28、13、32 号资源分别依次单独被鉴定出来，成为第十六、第十七、第十八和第十九组。

将资源分为19 组后，进一步利用更多的引物将所有资源鉴定区分。其中第四组的6 份资源利用引物2扩增出来的5 条特征性谱带(256 bp、309 bp、317 bp、322 bp、343 bp)继续进行鉴定。5 条特征性条带将6份资源分为5 个亚组，第一亚组:256 bp(＋)把17 号资源区分出来为一个小组；第二亚组:390 bp(＋)把20 号资源单独鉴定出来；第三亚组:18 号和23 号资源都有317 bp 条带被分为一组；第四亚组:同时包含322 bp和343 bp 特征性谱带的14 号资源被单独出定出；第五亚组:16 号资源为322 bp(＋)和343 bp(-)被鉴别出来。最后，利用引物62 扩增的特征性谱带250 bp，将18 号和23 号资源鉴定出来。另外5 组按照相同方法依次鉴定，直至所有资源区分开。CID 图谱是通过特征性谱带筛选比较，构建一个直观的鉴别图谱，1 个引物如果无法单独区分出资源，可用另一引物继续区分，直至所有资源被单独鉴定出，得到的图谱随时可以查阅。

表2 SSR 引物及退火温度Table 2 SSR primers and their annealing temperature

2.4 冬瓜资源鉴定结果的验证

根据构建的冬瓜CID 图谱关系，从组间或组内随机选取几份冬瓜资源，用相应引物对其可靠性和可利用性进行验证。如3 和12 号、10 和11 号、33 和34 号资源，分别进行验证。根据CID 示意图的结果，3 和12号利用引物16 和引物2 可以完全鉴定出来，依据有无304 bp 扩增条带可将3 和12 号资源分成两组(图3-A)；再由引物2 的特征性谱带309 bp 可把它们分别鉴定出(图3-B)。根据图3-C 和图3-D 所示，10 和11号资源、33 和34 号资源均可用引物2 区分开，差异条带分别为256 bp、300 bp 和300 bp、314 bp。

2.5 聚类分析

利用Ntsys2.10e 软件对40 份冬瓜资源的遗传多样性进行分析。由聚类图可知(图4)，遗传相似系数的变化范围为0.73～0.95，平均相似系数0.76，标记可将所有冬瓜资源区分开。以相似系数在0.77 处为阈值，可将40 份冬瓜分为3 个类群。第Ⅰ类中包括23 份资源，该类群主要以长圆筒形黑皮色冬瓜资源为主，种型大部分为有棱扁籽；第Ⅱ类中包括4 份资源，主要为长圆筒形冬瓜资源；第Ⅲ类中包括13 份资源，主要以果形短圆筒形、种子有棱扁籽粒为主。40 份冬瓜份资源间存在遗传差异，其中，7 和8 号资源相似系数为0.95，亲缘关系近难以区分，有可能是同物异名或标记数目少导致的。

3 讨论

形态学标记是一种直接利用表型性状对遗传多样性进行分析的标记方式，广泛应用于植物遗传多样性分析，但其结果往往依赖性状调查，当某一品种数量较多或形态上相似性较高时，用形态学标记的方法难以将它们区分开，而且有时易出现结果误差。DNA 分子标记技术操作简单，稳定性高，同时不受环境的影响。EST-SSR 是研究应用较多的一类标记方式。它以EST大量测序结果为基础，依据EST 序列进行SSR 标记挖掘，基于EST 序列所开发的SSR 标记在不同物种间通用性较高，使得EST-SSR 分子标记在分子标记辅助育种、多样性分析等方面具有应用价值[28-29]。张庆滢等[30]以22 份中国野生大麻(Cannabis sativaL.)和8份栽培品种为材料，利用EST-SSR 分子标记技术构建指纹图谱。DNA 指纹图谱鉴定品种准确性高，但这种方法只适用少数品种的鉴定区分。高源等[31]利用TP-M13-SSR 标记技术建立指纹图谱，并构建苹果(Malus pumilaMill.)栽培品种分子身份证。分子身份证是在指纹图谱基础上，将品种指纹数字化，能够更加简明的区分品种差异，然而此方法对种子纯度和遗传纯度有严格要求，对于可预见的变异没有统一的标准进行评定。随着品种数量增加，品种鉴定需要的标记组合越来越多，现有的标记组合已无法满足需求，造成了DNA 指纹图谱身份证数据库的局限性[32]。石艳等[33]以转录组序列为基础对换锦花(Lycoris sprengeri)SSR 分子标记大规模发掘，利用Ntsys2.10e 软件采用聚类分析法绘制聚类图，但聚类图存在无法直观的将各品种区分开的问题，它只能计算品种间的遗传距离和相似系数。

本研究采用Ntsys2.10e 进行聚类分析，在遗传距离0.77 处，40 份冬瓜资源被分成3 个类群，大致可以依据果形进行划分，这与焦贤贤等[3]的研究结果类似。然而，UPGMA 图只能简单区分品种间遗传关系，无法将品种单一地鉴定出来，且对遗传关系相近的品种也无法划分，表明该方法仍存在一定的不足。近年来，随着育种水平的提高和科学技术的发展，学者提出多种鉴定方法，如Wang 等[34]利用MCID 法鉴定了54份梅花种质资源亲缘关系。本研究基于EST-SSR 标记的MCID 法，将分子标记信息转化为有效信息并与品种鉴定相连接。试验利用全自动核酸蛋白分析仪对SSR 扩增产物进行检测，与传统的聚丙烯酰氨凝胶电泳法相比，该技术能准确获得谱带大小，且灵敏度高、用量小。

本研究共筛选出7 对引物，仅用3 对引物就成功将40 份冬瓜资源鉴定区分开；之后通过特征性谱带进行筛选，如果某一资源含有其他资源不具有的特征性谱带，则很容易将其与其他资源区分开，当某一引物无法区分时，则继续添加新的引物，最后根据分组结果建立冬瓜CID 图谱。当出现新的冬瓜资源需要与本研究的40 份资源进行区别时，可利用本研究筛选出的引物对新资源进行PCR 扩增分析，如果分析结果能够将新资源单独区分开，就可以将新资源和谱带添加到CID 图谱上，但当新的资源无法区分时，可使用新的引物对这些资源进行鉴别。MCID 法直观、简单、实用性和目的性强，能够用最少的引物快速区分40 份冬瓜资源，可有效地鉴定各种资源，为今后冬瓜种质资源鉴定提供参考。

4 结论

本研究利用DNA 分子标记技术对40 份冬瓜资源进行遗传多样性分析，结果表明，在遗传距离0.77 处，可将其分为3 个类群。结合MCID 法利用3 对ESTSSR 标记快速鉴定出40 份冬瓜资源，并构建了CID 图谱。从构建的CID 图谱能够有效地鉴定出40 份冬瓜资源之间亲缘关系，为资源的进一步利用提供了科学依据。同时，本研究采用的MCID 法还可用于冬瓜品种鉴定，解决品种中同物异名、同名异物、亲缘关系不清等问题，对今后冬瓜品种苗期鉴定、品种权鉴定及保护、种质资源管理等方面具均有参考价值。