MMP-9和COX-2在实验性牙周炎不同干预下的差异表达①

森巴特·毛吾艾，吴泽钰,2，吴仲蓬，王 琛，赵 今,2

（1新疆医科大学第一附属医院（附属口腔医院）牙体牙髓科，2新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，乌鲁木齐830054）

牙周病主要由细菌和宿主防御系统之间的稳定状态失调引起，会导致易感宿主的牙周破坏，从而引起炎症因子的过表达[1]。基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)是一种92 kDa型IV型胶原酶，其参与细胞外基质降解，组织重塑，细胞受体剥离，以及各种信号分子的加工[2]。环氧化酶是67-72 kDa的膜蛋白，是在催化膜磷脂花生四烯酸为前列腺素类物质过程里的重要限速酶[3]。环氧化酶有三型，1991年在细胞分裂的研究中发现环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2），其作为一种诱导酶，在牙周炎组织的各种细胞类型中表达，在牙周炎中起着重要作用[4]。本文旨在研究COX-2与MMP-9在实验性牙周炎大鼠牙周组织及全身中的表达情况及意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与主要仪器 苏木素-伊红染色液（中杉金桥）；TRAP染色试剂盒（北京索莱宝）；Anti-MMP-9抗体和Anti-COX-2抗体（博奥森）；MMP-9 ELISA Kit和COX-2 ELISA Kit（CUSABIO）；PV6001试剂盒及DAB显色液（中杉金桥）；全波长酶标仪（赛默飞世尔公司）等。

1.2 实验动物及分组 选取雄性SD大鼠，30只，新疆医科大学实验动物中心提供，温度25℃，湿度60%～70%，体重（250±50）g，统一饲料，自由饮食，分笼饲养，适应性喂养1周。对SD大鼠随机分组：正常组、牙周炎组、牙周炎+去结扎线组（去结扎线组）、牙周炎+单纯刮治组（刮治组）以及牙周炎+刮治组联合米诺环素组（联合组），每组6只。

1.3 实验方法

1.3.1 实验性牙周炎动物模型的建立及干预措施本实验选用单纯结扎法造模[5]，将无菌尼龙线（4-0）在大鼠的左上颌第一磨牙的牙颈部结扎，造模第15天后正常组及牙周炎组处死，其他组开始进行干预：去结扎线组仅去除结扎线；刮治组去除线后刮治，每周1次，持续2周，其余时候用牙间隙刷清洁牙面，每日1次，持续2周，并用0.9%生理盐水及3%双氧水交替冲洗；联合组给予刮治组的干预措施并于龈沟内给予20μL 2%的盐酸米诺环素，每日1次，持续2周。记录相关指标：牙龈的临床表现、探诊深度(probing depth,PD)及牙龈指数(gingival index,GI)。所有组均正常饮水饮食，干预组2周后处死并存好所需标本。1.3.2形态学观察 将牙体及牙周组织常规包埋、切片并进行HE染色、TRAP染色及免疫组化染色。在光学显微镜（德国Leica DM300)下拍照。免疫组化染色结果采用Image Pro Plus软件分析，用平均光密度值来表示。

1.3.3 ELISA检测血清中COX-2及MMP-9的表达各组大鼠麻醉后在腹主动脉上取外周血至肝素钠抗凝管中并静放2 h，离心15 min后取上清液-80℃冰箱留存，酶标仪450 nm下测定其光密度值。

1.4 统计学分析 采用SPSS21.0统计软件进行分析处理，结果采用（-x±s）表示。对同种测量值为连续数值型变量且服从正态分布的组间比较采用单因素方差分析；对不符合正态分布的数据，则采用K个独立样本非参数检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 X线结果 拍摄X线片，牙周炎组显示牙槽骨高度有所降低，与未结扎的邻牙牙槽骨形成鲜明对比，符合牙周炎表现从而表明造模成功（图1）。

2.2 牙周探诊深度与牙龈指数 刮治组及联合组的PD以及GI都明显低于牙周炎组，去结扎线组较牙周炎组有略微缓解，但差异不大（图2）。

图1 X线片表现

图2各组牙周探诊深度与牙龈指数对比

2.3 HE染色结果 正常组：牙龈上皮完整，上皮钉突多而长，未见炎症细胞浸润；牙周炎组：龈沟内可见结扎痕迹，上皮钉突消失，可见网眼状增生的上皮突向结缔组织，其周围可见大量炎症细胞浸润；去结扎线组：与牙周炎组差别不大；刮治组：牙龈上皮的连续性有一定程度的破坏，但固有层的炎细胞较牙周炎组相对减少；联合组：固有层的炎细胞明显减少，固有层有新生血管生成（图3）。

2.4 TRAP染色结果 正常组：几乎没有破骨细胞；牙周炎组：骨吸收陷窝可见较多破骨细胞，细胞形态各异，内有多个核存在于胞质中；去结扎线组、刮治组及联合组的破骨细胞数较牙周炎组有明显的减少（图4）。

图3各组HE染色结果（×100）

2.5 免疫组织化学染色结果COX-2、MMP-9阳性染色是棕色，主要表达在牙龈的上皮层，牙周膜上成纤维细胞的胞质，牙槽骨上的骨细胞胞质及松质骨骨髓腔内的成骨细胞胞质。正常组：阳性染色细胞数目少；牙周炎组：阳性染色细胞数目显著增多；去结扎线组、刮治组以及联合组阳性染色细胞数目较牙周炎组有不同程度的减少。采用Image Pro Plus软件分析并用平均光密度值来表示结果，结果显示牙周炎组与正常组、刮治组、联合组进行两两相比，COX-2和MMP-9的表达差异均有统计学意义（P＜0.05），但去结扎线组与牙周炎组相比差异无统计学意义（P＞0.05），详见图5、表1。

图4各组TRAP染色结果（×200）

表1牙周膜中COX-2与MMP-9平均光密度值

图5牙周膜中COX-2与MMP-9表达情况（×400）

2.6 ELISA检测分析结果 牙周炎组血清中炎症因子COX-2与MMP-9的含量比正常组显著升高，且差异具有统计学意义（P＜0.05），而去结扎线组与牙周炎组之间的差异不具有统计学意义（P＞0.05）；刮治组、联合组的COX-2与MMP-9的表达水平显著低于牙周炎组，且差异均具有统计学意义（P＜0.05），详见图6。

图6大鼠血清中MMP-9和COX-2的含量

3 讨论

牙周炎是人们熟知的慢性破坏性炎症性疾病，被认为是由于牙周组织的破坏和修复之间的不平衡引起的，由牙周袋中存在的细菌引发，并可能因全身疾病而加重[6]。事实上，大部分组织破坏是由宿主对口腔细菌的反应引起的，因此提出宿主反应调节治疗[7-8]。宿主反应调节治疗包括：使用非甾体抗炎药来减少COX-2从而降低其催化的代谢产物前列腺素的产生，达到减少炎症反应的目的[9]；使用多西环素或四环素类来减少宿主来源的基质金属蛋白酶，从而保存包括骨在内的牙周组织而不产生抗生素抗药性[10]；使用双膦酸盐来减少募集、依附和活化破骨细胞的特性，以及抑制基质金属蛋白酶，从而减少骨吸收[11]，由此可见COX-2、MMP-9在牙周炎的进展及炎症的消退阶段中起重要作用。

本实验采用丝线结扎法建立慢性牙周炎动物模型，2周后均出现明显的牙周炎表现，进行2周的干预后的治疗组组织形态学观察的炎症状态有所降低。这与Moro等[12]的造模后的炎症状态相似，其使用单纯结扎导致大鼠牙周炎后使用COX-2抑制剂后发现在第7、14、21天COX-2基因表达显著增加，但本研究只干预了2周后观察COX-2的表达变化，启示我们在疾病的进展阶段做到分批处死大鼠后观察炎症因子的变化，可能会更有说服力。Karatas等[13]亦使用单纯结扎导致大鼠牙周炎后使用天然药物肉桂酸进行干预，免疫组化染色结果可测得牙周炎组COX-2水平较高，肉桂酸降低了COX-2的表达水平，这与本研究结果一致，本实验免疫组化检测结果显示COX-2牙周炎组较其他组相比阳性染色细胞数目多，而刮治组与联合组COX-2阳性染色细胞数目有所减少（P＜0.05），提示在牙周治疗过程中随炎症程度的缓解，COX-2表达水平有所降低。

已有研究报道证明增加MMP-9蛋白表达导致促进破骨细胞形成和加速破骨细胞吸收[14]。Wu等[15]使用单纯结扎导致大鼠牙周炎后使用天然药物红茶中的多酚茶黄素进行干预，使用免疫组织化学染色评估MMP-9的表达，结果发现干预后会明显下调MMP-9的表达，这与本实验结果一致。Emingil[16]在一项随机实验中收集牙周炎患者龈沟液，ELISA检测发现多西环素治疗组患者的MMP-9表达水平降低，本研究中ELISA结果亦观察到牙周炎组血清中的MMP-9炎症因子水平升高，而干预组MMP-9炎症因子水平降低，提示在牙周治疗后随炎症程度的缓解，MMP-9会随之降低。

上述证据表明实验性牙周炎大鼠牙周组织中COX-2、MMP-9的表达水平会随着刮治等干预处理后有所降低，表明其可能是潜在的牙周炎的诊断指标，为后续靶向治疗提供新的思路。