HSP70对HepG2 2.15细胞HBV表达及Notch1信号通路的影响

荣海燕 蒋静 时瑛 薛黎

近年来，热休克蛋白(heat shock protein，HSP)在病毒复制领域的相关研究成为一个热点内容。HSP是一类普遍存在于真核和原核生物中的由应激诱导的保护细胞免受各种环境损害的高度保守蛋白质，根据其分子量的大小可分为6个家族：HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP、泛素[1]。其中分子量为70 kD 的热休克蛋白HSP70 在原核和真核生物体内可通过参与一些重要蛋白质的转位、折叠和装配，进一步影响蛋白质功能的完整性，被称为主要热休克蛋白[2,3]。研究表明，HSP70 是细胞内分子伴侣和折叠蛋白系统的核心“组件”，在一些病毒的复制起始、转录翻译和病毒粒子的装配过程中都有HSP70的参与，其作用机制可能是通过其“分子伴侣”特性，与病毒自身的某些重要蛋白发生结合，影响这些蛋白的空间构象，从而参与病毒生命周期的各个阶段，如转录、翻译、复制及组装[4,5]。Notch 信号通路是一种进化保守的信号通路，从果蝇到哺乳动物等许多生命体中普遍存在，在细胞的发育、分化、增殖、凋亡和调节组织内稳态及肿瘤形成中具有重要的作用。在哺乳动物中存在4 种Notch 受体(Notch1～4)和5 种Notch 配体，Notch 信号通路参与了多种疾病(包括恶性肿瘤)的发生、发展过程[6,7]，其中，Notch1 信号通路是目前研究最多的信号通路之一。近年来Notch1 信号通路与肝癌的相关性研究备受关注。在HBV与Notch1 信号通路交互作用方面，研究发现乙型肝炎病毒X 蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)可能是通过NF-κB 和Notch1 途径激活白介素-7受体(IL-7R)表达，进而促进乙肝病毒相关肝癌细胞的增殖和迁移[8]。由于病毒本身的复制能力有限，在很大程度上需要宿主蛋白来帮助其完成复制周期，为研究宿主蛋白HSP70 与HBV 复制的关系，本研究通过在HepG2 2.15 HBV复制细胞系中过表达HSP70来探讨HSP70对HBV表达及Notch1信号通路的影响，旨在为HBV相关肝细胞癌的基础研究、新药开发和临床诊疗等提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料 HepG2 2.15人肝癌细胞株来源于丰晖生物；Lipofectamine 3000 Transfection Reagent(Invitrogen)；TransDetect Cell Counting Kit (CCK) (全式金生物)；pENTER空载质粒(Vigene)；Anti-HSP70 Antibody、Anti-HES1 Antibody(博士德)；Anti-Notch1抗体(abcam)；HBV核酸测定试剂盒(达安基因)；人乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、人乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)(华美生物)；Real Time PCR instrument(ABI)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：HepG2 2.15细胞复苏后用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 U/ml链霉素、2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM培养液培养。细胞在5% CO2、37℃培养箱中常规培养。转染前1 d行HepG2 2.15细胞传代，并以5×104/ml接种于6孔板。取生长状态良好汇合率达90%的HepG2 2.15细胞，用完全培养基制备成5×104cells/ml单细胞悬液，每隔24 h接种至96孔板中(100 μl/孔，5个复孔，即5×103cells/孔)。8 d后小心吸干净细胞培养基，每孔加入100 μl配置好的10% CCK-8溶液，置于培养箱中37℃孵育，1 h后酶标仪450 nm波长检测OD值。绘制生长曲线，确定细胞株的对数生长期，用于后续实验。

1.2.2 HSP70过表达质粒构建：由乌鲁木齐欧易生物化学合成pENTER-HSPA4质粒，质粒送新疆昆泰锐生物测序，经分析合成序列与HSPA4参比序列一致。取生长状态良好汇合率达90%的HepG2 2.15细胞，胰酶消化细胞后，用无抗生素的培养基制备成5×104cells/ml单细胞悬液，接种至24孔板中，500 μl/孔，置37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中培养24 h。取3个2ml EP管设为A管、B管和C管，向A管中加入25 μl 无血清、无抗生素的培养基和0.75 μl Lipofectamine® 3000试剂，轻轻混匀。向B管中加入25 μl 无血清、无抗生素的培养基和1.5 μl LipofectamineTM3000试剂，轻轻混匀。向C管中加入50 μl的无血清无抗生素的培养基、1 μg PIRES2-ZSGreen1质粒、2 μl P3000TM试剂，柔和混匀。分别从C管中吸取25 μl置于A管、B管中，轻柔混匀，室温放置10 min。将混合后的DNA/lipofectamine复合物按50 μl/孔加到含有细胞的24孔培养板的孔中，轻柔摇晃细胞培养板。置37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中继续培养24 h、48 h后，进行转染后的荧光拍照，确定最佳转染条件。取空白对照组、转染后的空载组和HSP70过表达组细胞，每组3重复，Western blot验证HSP70过表达情况。

关于高表达的HSP70与肝癌细胞HBV表达的关系，有学者做了相关实验，将外源性Hsp70导入稳定表达HBV的2215细胞，使Hsp70基因高表达，结果使细胞内HBV复制增加了1.8倍；将特异性Hsp70 siRNA转染2215细胞，HBV复制显著降低，并且没有细胞毒性[10]。但是也有研究显示：HSP70可能通过抑制核心启动子Cp的活性抑制HBV的复制[11]。本研究结果显示：与空白对照组比较，HSP70过表达组HBsAg、HBeAg指标阳性表达显著增加，且细胞上清液中HBV-DNA浓度显著升高(P<0.05)。提示HSP70对HBV复制起促进作用。

关于HSP70与信号通路的关系，有报道，进入细胞外的HSP70能促进肝癌细胞的上皮细胞间质转化，影响肝癌细胞的迁移和侵袭能力，细胞外HSP70通过激活TLR2 和TLR4，继而激活细胞内的JNK1/2/ MAPK 信号通路从而促进肝癌细胞的增殖[12,13]。

1.2.3.2 ELISA检测细胞上清液HBV肝炎抗原HBsAg、HbeAg的表达量:按1.2.3.1实验分组进行转染，每组7个重复，取3组HepG2 2.15细胞培养上清，按照ELISA试剂盒说明书检测HBsAg和HBeAg表达。

1.2.3.3 荧光定量PCR检测细胞上清液HBV DNA载量:按1.2.3.1实验分组进行转染，每组5个重复，取3组HepG2 2.15细胞培养上清，按照HBV核酸测定试剂盒检测上清液中HBV DNA载量。

德国高迈特（KOMET）集团成立于1918年。其品牌定位于世界顶级行列，主要应用于孔加工领域，产品涵盖了整体/机夹式钻头、镗刀、铰刀和螺纹铣刀等，尤其在高效加工、精加工及重型机械加工领域有独到的优势。高迈特精密刀具（太仓）有限公司是KOMET旗下10余家公司之一，于2005年初成立。

HSP70在肝癌细胞中，有时表现为促进HBV复制的作用，有时又表现为抑制HBV复制的作用。我们推测可能是肝癌细胞内含有很多信号通路，有的通路促进病毒复制，有的通路抑制病毒复制，HSP70通过激活不同的信号通路从而表现出不同的作用结果。

综上所述,政策因素、参保方因素、医疗供方因素等是影响医保住院费用的主要因素,针对影响因素采取有效措施可以改善医保患者住院费用不合理现象。

1.2.3.1 实验分组:①空白对照组：HepG2 2.15细胞不做任何处理，正常培养48 h。②空载组：转染pENTER空载质粒，转染试剂浓度1.5 μl/ml，转染时间48 h。③HSP70过表达组：转染HSP70过表达质粒，转染试剂浓度1.5 μl/ml，转染时间48 h。

2 结果

2.1 HSP70过表达对HepG2 2.15细胞HBsAg和HBeAg的影响 ELISA实验结果表明：与空白对照组相比，空载组HBsAg、HBeAg表达差异无统计学意义(P>0.05)；与空载组相比，HSP70过表达组HBsAg、HBeAg阳性表达显著增加(P<0.05)。见表1、2。

表1 空白组和空载组 HepG2 2.15细胞上清中HBsAg 、HBeAg定性分析 例

表2 空载组和HSP70过表达组HepG2 2.15细胞上清中HBsAg 、HBeAg定性分析 例

如图2所示，直角部分可以采用两条Clothoid曲线A0和A1过渡，曲线A0和A1分别起始于点P0与P1，相遇于P，在起始点处与直线曲率相同为0，在点P两条曲线曲率相同并且切线平行反向，这样保证了整条运动轨迹曲率G2连续。

2.2 HSP70过表达对HepG2 2.15细胞HBV-DNA浓度的影响 RT-PCR实验结果显示：与空白对照组相比，空载组HBV-DNA浓度无改变(P>0.05)；与空载组相比，HSP70过表达后，细胞上清液中HBV-DNA浓度水平显著升高(P<0.05)。见表3。

表3 HSP70过表达对HepG2 2.15细胞上清液中HBV-DNA浓度的影响

2.3 HSP70过表达对HepG2 2.15细胞Notch1通道蛋白水平的影响 Western blot实验结果表明：与空白对照组相比，Hes1、Notch1蛋白浓度在HSP70过表达组显著升高(P<0.05)；与空载组相比，Hes1、Notch1蛋白浓度在HSP70过表达组显著升高(P<0.05)。见表4。

表4 HSP70过表达对HepG2 2.15细胞上清液中Hes1、Notch1蛋白浓度的影响

3 讨论

HSP70在肿瘤的发生发展中发挥着复杂而多样的作用，有时其扮演的角色甚至是对立的。一方面可以活化免疫细胞，激活机体细胞免疫，促进杀伤肿瘤，另一方面又可能通过复杂的通路，提高肿瘤细胞的免疫逃逸能力，从而减少肿瘤杀伤。大多情况下，HSP70在肿瘤细胞内表达增多，有文献推测：肿瘤的形成过程中，肿瘤细胞不断增殖，合成代谢增强，需要大量的HSP调节和稳定这一异常增殖过程，而肿瘤组织生长旺盛，其增生的血管存在相对供血不足，缺氧与应激的细胞环境也反过来诱导HSP的过度表达[9]。

1.2.3 过表达HSP70基因对HepG2 2.15细胞的影响

1.2.3.4 Western blot检测Notch1、Hes1蛋白的表达量:按1.2.3.1实验分组进行转染，每组3个重复，取3组HepG2 2.15细胞培养上清，三去污裂解液收获总蛋白，蛋白定量后经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。加入鼠抗人Notch1单克隆抗体(1∶1 000稀释)；鼠抗人Hesl单克隆抗体(1∶1 000稀释)；鼠抗人β肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体(1∶3 000稀释)。加入HRP标记的兔抗鼠二抗(1∶2 000稀释)。ECL曝光显影，计算机扫描蛋白质条带后进行灰度分析。将β-actin作为内参照，分别用Notch1/β-actin、Hesl/β-actin的比值来代表Notch1、Hesl蛋白的相对表达水平。

目前，进口钾到货量较低，库存持续消耗，市场可售现货偏紧；各方对钾肥大合同涨价预期较强，报价有不同程度提高；但钾肥实际需求仍无明显起色，市场多以观望为主。盐湖提价后，市场进入新价格消化期，将继续对钾肥市场起到支撑作用；国际钾肥市场仍呈现供应偏紧状态，贸易商涨价意愿较强。预计短期内国内氯化钾价格将保持高位坚挺、稳中探涨态势，重点关注国内钾肥大合同谈判情况。

本研究结果显示：与空载组相比，Notch1信号通路蛋白Notch1、Hes1蛋白浓度在HSP70过表达组显著升高(P<0.05)。提示HSP70可能通过激活细胞内的Notch1通路影响肝癌细胞的生物学行为。

(1)树立“无障碍网络教育”的理念。政府和教育者要加大对障碍人士的关注。目前在无障碍网络教育这一块的研究还相对稀有，这是不利于网络课程全面化、全民化发展的。

Notch 信号通路可以通过上调Hes1 的表达而影响细胞的生理。Notch信号通路的功能与细胞的特定类型有关，在不同的胚胎、组织或肿瘤中发挥着不同的作用[14]。有研究报道，Notch信号通路抑制肝癌细胞增殖，Notch1 通过作用于不同的细胞调节因子，诱导细胞周期G0/G1 期阻滞，从而抑制肝癌细胞的增殖，同时Notch1通过改变p53/Bcl-2 平衡，促进肝癌细胞凋亡[15]。也有研究显示：Notch信号通路促进肝癌的发展，患者肝癌组织中有Notch的核内异常表达，用siRNA 敲低Notch3 的mRNA 能增强肝癌细胞对化疗药物的敏感性[16]。

目前市场上工业通信产品大体可以归结为四类：“三硬一软”，即包含数采通信、边缘计算、网络基础设施硬件产品以及为之服务的软件管理产品，整合工业通信设备与软件的能力，为广大的系统集成商施展才华留下了巨大的空间。而对于MOXA来说，成立30多年来，始终专注于工业领域的通信解决方案，累积了非常丰富的场景经验，研发出无数业界领先的专利技术。

综上所述，HepG2 2.15细胞内HSP70过表达促进HBV复制，并且细胞内Notch1、Hes1蛋白浓度升高，为肝癌的分子机制、靶向治疗提供了可能的思路，但是HBV复制的增加与Notch1信号通路之间的相互作用和相关的分子机制有待进一步研究。