TRPV4基因的两个不同变异导致变形性骨发育不良表型严重程度差异

袁佳雨，孙东兰，李亚洲

（1河北医科大学第三医院，石家庄 050000；2石家庄市妇产医院，石家庄 050000）

骨骼发育不良（skeletal dysplasia， SD）是一大类具有很强遗传异质性的严重出生缺陷，其临床特征是骨和软骨的生长、发育、分化及维持的异常[1]。SD的总体发生率约为1/5000，占新生儿出生缺陷的约5%，其表型严重程度各异，范围可从轻度身材矮小到围产期致死[2]。根据最新的分类方式，SD可分为42大类，461个病种，目前已知涉及的基因超过437个[3]。然而，对于某种特定SD，可能由于其罕见、异质性强、致病机制复杂，而造成诊疗十分困难。

变形性骨发育不良（metatropic dysplasia， MD，MIM #156530）是一种罕见的SD病种，最早由Maroteaux等人定义[4]。MD患者的主要临床特征是四肢较短，长骨变形且较短，关节的受限和增大，通常有脊柱侧凸[5]。影像学检查特征包括胸部狭窄，肋骨短，髂骨膨出，扁平椎且椎体拉长，长骨干骺端增大[6]。根据个人观察和对文献的回顾，Beck等认为MD至少包括三个遗传学亚型：一种非致死性常染色体隐性遗传型，一种非致死性显性遗传型，和一种出生前或产后不久即死亡、可能的常染色体隐性遗传型[7]。然而，目前的共识是，MD是一种由TRPV4基因的杂合子致病性变异所引起的常染色体显性疾病[5，8]。TRPV4基因（MIM *605427）编码瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员4（transient receptor potential cation channel subfamily V member 4，TRPV4），是一种钙渗透非选择性阳离子通道[9]。TRPV4通过介导钙内流在软骨细胞分化和破骨细胞终末分化中起着重要的作用[10，11]。

本研究中，我们报道2例骨骼发育不良的病例，有着较大的表型严重程度差异。通过遗传学检测，在先证者样本中分别检出2个不同的TRPV4基因致病性变异。本研究的结果为该患病家庭的遗传咨询和再生育指导提供了重要根据，同时也为理解TRPV4的功能提供了一定理论支撑。

对象和方法

1 对象

本研究纳入了2例骨骼发育不良的患者及其父母。病例1（Case 1）先证者是一位4岁女孩，因跌倒后右踝关节肿胀不消来院治疗。其父母均体健，非近亲关系，患儿是该夫妇第一个孩子（家系图见图1A）。影像学检查结果显示，该患儿右侧胫腓骨远端骨折，髋骨损伤和多发性骨病变（图1B、C）。病例2（Case 2）是一例引产胎儿，其父母体健，非近亲关系，无遗传病及出生缺陷家族史（家系图见图1D）。孕22周排畸超声检测结果显示，胎儿股骨、胫腓骨和肱骨明显短小而弯曲，脊柱侧凸，椎体排列紊乱（图1E、F）。由于临床预后评估不良，该对夫妇自愿选择引产。27周引产后的胎儿影像学表现和超声吻合（图1G、H）。

2 样本采集

本研究收集临床2例不同表型严重程度的骨骼发育不良个体及其父母，抽取病例1及其父母、Case 2父母各2管外周血，每管5 mL，分别为肝素钠抗凝及EDTA-纳抗凝；依常规抽取Case 2胎儿孕期脐血样本3 mL，分装各1.5 mL分别用上述两种抗凝剂抗凝。

3 染色体核型分析

对2个先证者外周血样本依照常规方法进行传统的G显带核型分析[12]。核型结果依据国际人类细胞遗传命名体系（ISCN 2016版）进行分析。

4 基因组DNA提取

使用EDTA-纳抗凝血样本，依常规方法提取基因组DNA，采用北京天根公司的TIANamp试剂盒。测得各样本浓度均大于50 ng/μL，OD值260/280在1.8-2.0范围内，满足后续试验需求，-20℃冻存。

5 染色体微阵列分析（Chromosome Microarray Analysis，CMA）

采用美国昂飞公司的CytoScan 750K染色体微阵列体系，采用厂家推荐方法对先证者的组DNA样本进行消化、扩增、纯化、片段化、标记、杂交、洗涤、染色和扫描。使用体系配套ChAS软件分析实验数据。对于基因组拷贝数变异设定疑似阳性阈值为：缺失或重复≥400 kb，杂合性缺失（loss of heterozygosity ，LOH）大于等于10 kb。

6 全外显子组测序（Whole Exome Sequencing，WES）

首先对DNA双端进行修复，在3’端加1个A碱基。然后，将其连接测序adaptor，使用XP beads收集320 bp左右的片段。经PCR扩增，依据厂家提供方法，用IDT’s xGen Exome Research Panel （Integrated DNA Technologies，美国）将DNA片段杂交捕获，洗脱并收集杂交产物。然后DNA经PCR扩增并纯化。接着，用qPCR法检测文库富集情况，用Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies，美国）鉴定文库片段分布和浓度。最后，使用Novaseq6000（Illumina，美国）检测150 bp的pair-end读长，从而对组DNA完成测序。原始数据使用CASAVA v1.82软件进行分析。测序数据用Burrows-Wheeler Aligner软件以人类基因组参考序列（版本号hg19/GRCh37）进行比对，以Picard v1.57（http://picard.sourceforge.net/）对PCR重复加以移除。使用Verita Trekker® Variants Detection System（贝瑞基因，北京）和GATK（https://software.broadinstitute.org/gatk/）软件进行变异筛选。使用ANNOVAR[13]和Enliven® Variants Annotation Interpretation System（贝瑞基因，北京）对变异进行注释和解读。

7 生物信息学分析

依照标准方法，使用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）和Swiss-Pdb Viewer（https://spdbv.vital-it.ch/disclaim.html）对野生型和突变型蛋白结构进行构建和分析。

结 果

1 临床分析

依据临床和影像学指征，2个被纳入的病例分别是轻度和重度的骨骼发育不良。病例1为轻型，其表现有轻度的脊柱侧弯，胸廓狭窄和干骺端加宽（图1 B、C）。病例2为重型，引产后的X光检测显示四肢长骨短，呈哑铃状，伴脊柱畸形（图1 G、H）。

图1 家系图和患儿的临床表征图。A，病例1的家系图（先证者用黑色箭头标示）。B和C，病例1中患儿的X光影像，显示有轻度的脊柱侧弯，胸廓狭窄和干骺端加宽。D，病例2的家系图（先证者用黑色箭头标示）。E—H， 病例2患儿孕期超声（E、F）及引产后X光（G、H）影像，显示有严重的脊柱侧凸，长骨呈哑铃形，干骺端不规则，四肢及躯干短小。Fig. 1 Pedigrees and clinical imaging data of the two metatropic dysplasia cases. A， pedigree of Case 1 in which the proband is indicated with dark arrow. B and C， X-ray images in Case 1 showed mild scoliosis， small chest， and mild metaphyseal widening. D， pedigree of Case 2 in which the proband is indicated with dark arrow. E to H， ultrasound images during pregnancy (E， F) and X-ray images post induced labor (G， H) of case 2 exhibited severe scoliosis， dumbbell-shaped long bones with metaphyseal irregularity， short extremities， and a short trunk

2 遗传学分析

个先证者的染色体核型及CMA结果都未见异常（图2）。全外显子组测序检出TRPV4基因的两个杂合突变，以NM_021625转录本为准，分别是：病例1患儿的TRPV4: c.2389G＞A(p.E797K)错义变异，和病例2患儿的TRPV4: c.1412_1414del(p.F471del)整码缺失变异。其中，前者造成TRPV4编码肽链797位的谷氨酸被赖氨酸替换，后者造成肽链471位的苯丙氨酸缺失（图3）。经Sanger测序验证发现，2个先证者的父母均为野生型，因此两个变异均为新发（de novo）变异。

图2 G显带核型分析。病例1为46， XX核型，病例2为46，XY核型Fig. 2 G banding karyotype analysis. G banding karyotype of Case 1 was 46， XX; and G banding karyotype of Case 2 was 46， XY

图3 2个病例中检出变异的Sanger测序结果，以及该变异在TRPV4蛋白分子特定结构域中的位置。病例1 c.2389G＞A错义突变造成TRPV4编码肽链797位的谷氨酸被赖氨酸替换；病例2 c.1412_1414del整码缺失变异造成肽链471位的苯丙氨酸缺失Fig. 3. Sanger sequencing results， and the locations of the implied sequence changes in specific domains of the TRPV4 protein molecule in two cases. The c.2389G＞A mutation in Case 1 caused lysine to replace glutamate at peptide 797 of TRPV4; the c.1412_1414del mutation in Case 2 caused phenylalanine deletion at peptide 471

3 生物信息学分析

经数据库筛选，选择PDB：6dvy.1.A（Seq Identity: 47.67%/ GMQE: 0.37）作为TRPV4: c.2389G＞A(p.E797K)错义变异相对应的野生型模板，构建野生、突变型的蛋白结构模型。三维结构分析显示，p.E797K变异使相应氨基酸的氢键距离变小，从而可能导致蛋白结构的稳定性受到影响（图4）。

图4 对TRPV4: c.2389G＞A(p.E797K)错义变异的生物信息学结构分析。A，TRPV4蛋白在该特定区段内的野生型结构模型。B，A中红色框线内的细节，含有E797氨基酸。C，E797K变异导致氢键距离自3.27pm（L）变至2.64pm（S）Fig. 4 Biophysical analysis of the TRPV4: c.2389G＞A(p.E797K) variation. A， part of the three-dimensional structure of the wild type TRPV4. B， the detailed red block in A showing E797. C， the E797K mutation caused the hydrogen bond distance to change from 3.27pm (L) to 2.64pm (S)

讨 论

人类TRPV4蛋白肽链含有871个氨基酸残基，包含1个脯氨酸富集区段，6个锚蛋白（ankyrin，ANK）重复区，6个跨膜（transmembrane ，TM）功能域，以及1个钙调素结合区（图2）[14]。Everaerts等指明，在TM5和TM6之间存在一个假定的阳离子渗透孔[14]。近年来，TRPV4基因的致病性变异先后被证明可以导致一系列骨骼发育异常性疾病，包括常染色体显性brachyolmia病（BO，MIM #113500）、脊椎干骺端结构不良Kozlowski亚型（spondylometaphyseal dysplasia Kozlowski type，SMDK，MIM #184252）以及MD[15，16]。最初，MD的遗传方式被认为比较复杂，兼有常染色体显性和隐性两种模式[7]。Beck等认为该病可以符合常染色体隐性模式，是因为发现一对健康夫妇重复多次分娩该病的患儿[7]。Kannu等发现在报道的病例中，受累与未受累的比值（1:20）并不支持常染色体隐性模式[17]。他们认为子代重复患病的可能原因是亲本的生殖腺嵌合。随后，大量报道都支持MD符合常染色体显性遗传模式[5，8]。本研究中，我们在TRPV4基因检测出2个新发杂合变异，c.2389G＞A(p.E797K)和c.1412_1414del(p.F471del)，符合该模式。本研究生物信息学结构分析有力的支持了c.2389G＞A变异的致病性，并且在亚分子水平为其导致的可能的蛋白结构改变提供了一定的线索。但具体的影响，还倚赖结构生物学实验的进一步探究。

MD患者表型的严重程度可能会有比较大的差别[4]。从临床角度可以将MD分为轻型、经典型和致死型，但各亚型之间并不能完全明确区分开[7]。迄今为止的文献报道中，TRPV4基因变异所在的特定功能域和疾病表型严重程度并没有呈现明显的关联[8，18]。此外，Dai等指出，TRPV4基因的15号外显子是MD相关变异的一个热点区域，在他的研究中占了60%（14/23）的比重[6]。本研究中的2个变异，都是可重复发生的变异。其中，TRPV4: c.2389G＞A(p.E797K)报道过3次[6，8，19]。TRPV4已知的致病性变异大部分属于错义变异，符合“获得功能”（gain-offunction，GOF）的机制[20]。TRPV4基因的GOF变异可以激活钙通道，导致细胞内Ca2+水平升高和软骨细胞分化的异常[8，21]。本研究的另一个变异TRPV4: c.1412_1414del(p.F471del)是第一个被报道的非错义变异，它导致一个进化保守的氨基酸缺失，并且造成了患儿的夭折，这与本研究的表型相符[6，8]。我们推测，TRPV4变异所致MD的表型严重程度应当与变异类型及其所在功能域具体位置有关，但是这种关联还需要大样本的数据归纳总结才能有效建立。

Sox9是一种转录因子，启动间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）向软骨细胞分化，对软骨形成的早期阶段至关重要[22]。Sox9还通过指导软骨特异性细胞外基质分子的表达在软骨内骨化中起着关键作用，包括软骨内骨化[23，24]。最近的一项研究指出，TRPV4基因的GOF变异可导致牙髓干细胞细胞内Ca2+离子水平失调以及Sox9的上调[21]。NFATc1负责破骨细胞特异性的基因转录，从而促进成骨细胞的分化[25]。而TRPV4基因的GOF变异通过增加Ca2+/NFATc1途径的活性来破坏成骨细胞的分化，并诱导与MD相关的软骨内骨化紊乱[26]。因此，每个变异所导致的表型很可能取决于Sox9和NFATc1的活性程度。而这也可能部分解释了TRPV4基因中的不同变异如何导致MD的不同表型严重程度。

综上所述，本研究在两个变形性骨发育不良病例中分别检测到了2个新发杂合致病性变异TRPV4: c.2389G＞A(p.E797K)和TRPV4: c.1412_1414del(p.F471del)。结果表明受累家庭的再发风险较低。另外，研究表明WES可作为一项快速、准确的分子遗传学诊断方法，对围产期及儿科骨骼异常予以诊断。