甲基转移样酶1在胶质母细胞瘤中高表达并与促胶质母细胞瘤生长有关

张旭，曾智，熊晓星*

（武汉大学人民医院1神经外科，2病理科，武汉 430060）

胶质瘤是颅内发病率最高的原发性中枢神经系统肿瘤，其中胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是WHO Ⅳ级的高级别星形细胞肿瘤，具有恶性程度高、预后差、死亡率高等特点；胶质母细胞瘤确诊后，患者平均生存时间约为12个月[1，2]。颅内占位切除配合术后放化疗是目前临床治疗胶质母细胞瘤的主要手段，但由于肿瘤侵袭性强，与周边正常脑组织边界不清，导致手术治疗效果相较于其他颅内肿瘤更差。除此之外，放化疗的应用对GBM患者整体预后影响的作用也较为有限[3]。

甲基化是细胞表观遗传学调控的重要方式，甲基化通过影响基因组基因转录、翻译过程的稳定，进而影响相关基因的表达，对包括胶质瘤在内的多种恶性肿瘤的发生、发展有着重要影响，并有一定的诊断、治疗指导意义[4]。甲基转移样酶1（methyltransferase-like 1，METTL1）是一类RNA甲基转移酶，通过催化tRNA m7G修饰，驱动细胞肿瘤样转化，并在肺癌、胃癌及肝内胆管癌等恶性肿瘤的研究中被认为有促癌效应[5-7]。有分析表明tRNA甲基转移酶的基因扩增是胶质母细胞瘤中的常见现象，而METTL1被鉴定为胶质母细胞瘤中扩增最高的tRNA甲基转移酶[8]。本文检测METTL1蛋白在胶质母细胞瘤及正常脑组织中的表达及定位，并结合患者临床病理特征，探讨METTL1在胶质母细胞瘤发生、发展中的作用。

材料与方法

1 临床资料与组织标本

收集武汉大学人民医院2018年1月至2021年1月病理确诊为脑胶质母细胞瘤的病例60例，收集患者的临床病理资料（性别、年龄、肿物大小，病灶部位、病灶原发/复发性质、术后复发情况、转移情况、基因检测）。并收集同时期因脑外伤手术取出正常脑组织送检的病例10例作为阴性对照。所有患者均签署知情同意书。找出70例患者对应的HE染色切片及组织蜡块，组织HE染色切片重新阅片选点并于蜡块做相应标记后制成组织芯片。

2 数据库数据分析

从UCSC Xnea网站（https://xenabrowser.net/）下载TCGA Glioblastoma（GBM）数据库，筛选出胶质母细胞瘤及正常脑组织中基因表达数据及相关病例临床病理资料进行分析。从门户网站Depmap （https://depmap.org/portal/）中下载阿喀琉斯项目（Project Achilles，https://depmap.org/portal/achilles/）全基因组CRISPR/Cas9敲除文库筛选数据，并分析该计划通过CRISPR/Cas9技术敲除多种胶质母细胞瘤细胞系内METTL1表达后，计算得出的提示关键基因可能性的Chronos依赖度评分。

3 免疫荧光染色

组织切片二甲苯脱蜡，梯度浓度乙醇水化后，柠檬酸盐溶液微波抗原修复，室温封闭后，兔抗人METTL1多克隆抗体（14994-1-AP，Proteintech，Wuhan，China，工作浓度1:400）分别与鼠抗人GFAP单克隆抗体（ab4648，Abcam USA，工作浓度1:100）或鼠抗人NeuN单克隆抗体（ab104224，Abcam USA，工作浓度1:100）混合后4 ℃过夜孵育，次日复温后，用山羊抗兔红色荧光二抗（ab150080，Abcam USA，工作浓度1:1000）及山羊抗鼠绿色荧光二抗（ab150117，Abcam USA，工作浓度1:1000）混合孵育，漂洗后滴加含DAPI的抗荧光淬灭封片剂，盖玻片封片后放于暗盒，4℃保存，并用正置荧光显微镜阅片并采集图像。

4 SP法免疫组织化学染色

即用型免疫组织化学UltraSensitive SP超敏试剂盒（鼠/兔，KIT- 9710）和 DAB 显色试剂盒购自福州迈新公司。一抗为兔抗人METTL1多克隆抗体。组织芯片二甲苯脱蜡，梯度浓度乙醇水化后，柠檬酸盐溶液微波抗原修复，后续按试剂盒说明书滴加试剂进行免疫组织化学染色，其中一抗稀释至1:400工作浓度后，4 ℃过夜孵育。

5 免疫组织化学结果判定

免疫组织化学结果由两位临床病理医师独立阅片读取。METTL1主要在胶质母细胞瘤细胞及正常脑组织细胞的细胞核中表达，半定量积分法评估阳性细胞数及阳性表达强度。染色强度方面：无阳性着色为0分，着色强度呈浅黄色为1分，黄色为2分，黄褐色为3分。阳性细胞比例方面：＜10%为0分，10%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。表达水平采用两项结果乘积（Score = 0—12，图1）为最终结果：≤6分为阴性组，＞6分为阳性组。

图1 METTL1在胶质母细胞瘤及正常脑组织中表达的SP 法免疫组织化学染色与评分。黑箭头示神经元细胞，白箭头示星形胶质细胞。比例尺：A，B，E—H，100 μm；C和D，20 μmFig. 1 SP immunohistochemical staining of METTL1 expression and scoring in glioblastoma and normal brain tissues. The black arrows point to neurons， and the white arrows point to astrocytes. Scale bar， A， B， E to H， 100μm; C， D， 20μm

6 统计学分析

统计分析应用SPSS22.0软件，计数资料用率表示，并用χ2及Fisher精确检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 METTL1定位于正常人脑神经元和星形胶质细胞核内

蛋白分析网站The Human Protein Atlas（www.proteinatlas.org）收录了METTL1在人胶质瘤细胞系U-251、人前列腺癌细胞系PC-3和人鳞状细胞癌细胞系A-431中的免疫荧光表达，均显示METTL1主要富集在细胞核中，在胞质内也可见少许表达（图2）。本实验免疫荧光结果与蛋白分析网站The Human Protein Atlas中的结果符合，显示METTL1广泛表达在正常脑组织神经元及星形胶质细胞的细胞核中，但METTL1在神经元细胞核内的表达量要明显高于星形胶质细胞（图3）。

图2 METTL1在U-251、PC-3和A-431细胞系中的表达定位。比例尺，20μmFig. 2 Expression and localization of METTL1 in the U-251， PC-3 and A-431cell lines. Scale bar，20μm

图3 METTL1蛋白在正常脑组织中的表达。长箭示神经元，短箭头示星形胶质细胞。比例尺，100μm。Fig. 3 Expression of METTL1 protein in normal brain tissues. The long arrows indicate the neurons， and the short arrow heads indicate the astrocytes. Scale bar， 100μm

2 METTL1 mRNA在人胶质母细胞瘤组织中的表达水平较正常人脑组织高

TCGA数据库TCGA Glioblastoma（GBM）收录了631例人脑胶质母细胞瘤及正常人脑组织标本mRNA表达水平信息，其中167例胶质母细胞瘤组织及5例正常脑组织有METTL1的mRNA表达水平数据。对两种组织中METTL1 mRNA表达水平的比较显示，胶质母细胞瘤组织中METTL1 mRNA 水平显著高于正常脑组织（P＜0.001）（图4）。

图4 METTL1 mRNA水平在正常脑组织和和胶质母细胞瘤组织中的差异Fig. 4 Difference of METTL1 mRNA levels between normal brain tissue and glioblastoma tissue

3 METTL1蛋白在人胶质母细胞瘤中的表达水平较正常人脑组织高

组织芯片上含有60例胶质母细胞瘤组织及10例脑外伤术中取出的正常脑组织，经过免疫组织化学染色及形态学阅片后发现，有 54例胶质母细胞瘤组织具有完整的肿瘤成分，其余位点存在掉点或结果无法判读，而10例正常脑组织保持完整；METTL1阳性信号主要定位于细胞核，在胶质母细胞瘤组织中METTL1蛋白主要表达于肿瘤细胞；在正常脑组织，METTL1蛋白在正常胶质细胞及神经元细胞均有表达。比较发现， METTL1在胶质瘤组织中的阳性表达率为50%（27/54），明显高于正常脑组织中的胶质细胞0%（0/10） ( χ2=8.649，P=0.0033，图5)。

图5 METTL1水平在胶质母细胞瘤及正常脑组织中的差异Fig. 5 Difference of METTL1 levels between normal brain tissue and glioblastoma tissue

4 胶质母细胞瘤METTL1表达水平与患者临床病理特征无明显相关

54例胶质母细胞瘤患者平均年龄为52.5岁，肿瘤平均体积为32.8 cm3，统计学分析后发现METTL1水平与患者性别、年龄、肿瘤体积、发病部位及病灶的原/复发性质无明显相关性（表1）。TCGA数据库TCGA Glioblastoma（GBM）收录的167例胶质母细胞瘤中有166例有总体生存随访数据，死亡133例，存活33例，随访时间5～2681天。取METTL1 mRNA表达较高的55例为高表达组，较低的55例为低表达组。METTL1高表达组死亡47例，存活8例，中位生存时间394 d；METTL1低表达组死亡43例，存活12例，中位生存时间333 d。绘制生存曲线，分析显示METTL1 mRNA表达与患者预后生存时间之间无相关性（P=0. 296）（图 6）。

表1 METTL1蛋白表达与胶质母细胞瘤患者临床病理特征的关系Tab. 1 Relationship between METTL1 levels and clinicopathological features of patients with glioblastoma

图6 METTL1 mRNA水平与胶质母细胞瘤患者预后的生存曲线Fig. 6 METTL1 mRNA levels and survival curves of patients with glioblastoma

5 METTL1敲除抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖与细胞活力

门户网站Depmap收录了阿喀琉斯项目根据35种胶质母细胞瘤细胞系通过CRISPR/Cas9技术敲除METTL1表达后的增殖能力和细胞活力变化得出的Chronos依赖度评分。分析可见，35种胶质母细胞瘤细胞系针对METTL1的Chronos依赖度评分均低于0，提示METTL1的敲除可以不同程度地抑制各种细胞系来源的胶质母细胞瘤细胞的增殖与活力。而对于Chronos依赖度评分低于-1分的细胞系U343，LN340，YKG1及LN428，METTL1很有可能是其生存的关键基因（图7）

图7 胶质母细胞瘤细胞系对METTL1表达依赖性分析。Chronos依赖度评分基于细胞CRISPR/Cas9技术基因敲除实验的数据。越低的分值意味着越高的关键基因可能性。0分预示着基因不是关键基因，而-1分是所有泛关键基因的中位分值。Fig. 7 Dependence of METTL1 expression on glioblastoma cell lines. Chronos dependence score was based on data from cell CRISPR/Cas9 knockout assay. The lower the score， the higher the likelihood of an essential gene. A score of 0 indicates that a gene is not a critical gene， while -1 is the median score for all pan-essential genes.

讨 论

甲基化是表观遗传学调控的重要机制之一，通过催化甲基基团与DNA、组蛋白、RNA等遗传大分子结合，动态地维持基因组信息遗传与表达的稳定，影响细胞的分化与发展[4]。METTL1是一类正在被深入研究的RNA甲基转移酶，催化tRNA的N7甲基鸟苷（m7G）修饰，而tRNA是修饰程度最高的RNA，其表观遗传学调节的失衡与诸多肿瘤相关[9]。

近年来，METTL1与肿瘤的研究有了诸多进展。METTL1与WD 重复结构域 4 （WD Repeat Domain 4，WDR4）共同构成甲基转移酶复合物，这两个分子在多种恶性肿瘤的研究中被证明具有促癌效应，并影响预后。研究表明肺癌样本中，METTL1与WDR4的表达水平显著增高，且与预后负相关，相关机制研究表明METTL1促进肺癌细胞的生长与侵袭[5，10]。METTL1及WDR4在肝内胆管细胞癌中的上调与不良预后相关，机制实验证明该复合体促进肿瘤细胞的存活和进展[6]。在肝癌、胃癌等恶性肿瘤中，METTL1也有类似的促癌效应[7，11]。但在结肠癌组织中，METTL1低表达，且相关机制研究表明METTL1在结肠癌中呈现出抑癌的功能。METTL1对肿瘤的抗癌药敏感性也有影响。在HeLa细胞系联合敲低METTL1和NSUN可以显著增加细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性[12]。在结肠癌细胞中过表达METTL1可以增加其对顺铂的敏感性[13]。可以看出，在不同种类的肿瘤中，METTL1对肿瘤的发生发展及抗癌药敏感性有着不同的影响，其机制需进一步研究。

近年来，METTL1与胶质母细胞瘤的关系方面的研究主要在生物信息学分析预测方面[14-16]。Ping等通过对多维基因组数据分析，找到了一个包含了17个基因的胶质母细胞瘤核心基因模块，其中METTL1是评分最高的相关基因，可以富集到多个肿瘤相关的功能及通路上[15]。Shruti Bhargava等通过qRT-PCR发现METTL1在胶质瘤细胞中高表达，他们对数据库的表达数据分析也表明，METTL1在胶质母细胞瘤中高表达[16]。

本观察中，免疫荧光染色显示在正常脑组织中，作为胶质母细胞瘤起源的星形胶质细胞在非癌变状态下，其核内表达的METTL1蛋白水平明显低于正常神经元细胞。对TCGA数据库的分析以及前述的相关研究背景表明，以癌变的星形胶质细胞为主要成分的胶质母细胞瘤组织中METTL1 mRNA相对表达量明显高于正常脑组织。本实验收集并研究了54例胶质母细胞瘤组织及10例正常脑组织，发现METTL1蛋白在胶质母细胞瘤组织中明显表达上调，提示METTL1蛋白高水平与胶质母细胞瘤的发生密切相关。进一步的临床病理参数分析发现，METTL1的高表达与患者性别、年龄、肿瘤体积、发病部位及病灶的原/复发性质无明显相关性，对TCGA数据库生存随访数据的分析也表明，METTL1 mRNA表达水平的高低并不能用来预测胶质母细胞瘤患者生存时间的长短。

阿喀琉斯项目利用基于慢病毒的RNA干扰技术，或CRISPR-Cas9技术沉默或敲除个体基因进行基因组尺度的基因功能缺失筛选，并应用Chronos模型基于细胞增殖、细胞活力等参数计算CRISPR-Cas9技术产生的基因敲除效应，并给出整合性Chronos依赖度评分[17]。越低的分值意味着越高的关键基因可能性。0分预示着基因不是关键基因，而-1分是所有泛关键基因的中位分值。该项目收录的35种胶质母细胞瘤细胞系针对METTL1的Chronos依赖度评分均低于0，其中细胞系U343，LN340，YKG1及LN428对应的评分均低于-1，提示METTL1的敲除可以不同程度地抑制各种细胞系来源的胶质母细胞瘤细胞的增殖与活力，且可能是多种胶质母细胞瘤细胞的生存关键基因。

综上所述，METTL1蛋白高水平表达与胶质母细胞瘤的发生有关，降低其表达可以抑制胶质母细胞瘤细胞的生长水平，但其与患者临床病理特征的关系有限，在预测患者生存及预后方面作用有限。