ZNF488通过PI3K/AKT通路促进胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭并抑制其凋亡

何由之，蔡兵

（南京医科大学附属无锡市人民医院普外科 无锡 214023）

胰腺癌是一个具有侵略性的肿瘤，胰腺癌是死亡率最高的癌症之一，与较差的生存率相关[1，2]。据统计胰腺癌患者的5年生存率不到9%[3]，目前手术治疗是临床上有效的治疗方式，然而由于胰腺癌晚期和具有转移性，导致手术的切除肿瘤的治疗方法仅适用于少部分的患者[4]，因此寻找胰腺癌新的治疗靶点非常重要。锌脂蛋白488（zinc finger protein 488， ZNF488）是辛脂蛋白家族中的成员，可参与调控癌细胞的进程。有研究表明，ZNF488基因在鼻咽喉癌细胞中高表达，且过表达的ZNF488可促进鼻咽喉癌细胞的增殖和迁移[5]，同时也有研究证实，敲低ZNF488的表达，可显著抑制辅导诱导的鼻咽喉癌细胞的迁移侵袭能力[6-7]。但是关于ZNF488在肿瘤调控中的作用机制还研究较少。本研究在前期研究中发现ZNF488在胰腺癌中高表达，然而关于ZNF488在胰腺癌中的作用和调控机制还未见报道。已有研究证实PI3K/AKT通路在胰腺癌的发展中发挥着重要的作用，例如，MMP28可通过调控PI3K/AKT通路影响胰腺癌的进程[8]；敲低TBL1XR1的表达可显著抑制胰腺癌细胞的增殖和侵袭，其机制与PI3K/AKT通路有关[9]。但ZNF488在胰腺癌中的调控机制是否也跟调控PI3K/AKT通路相关还不清楚。本研究旨在探讨ZNF488在胰腺癌中的调控机制，为胰腺癌的靶向治疗提供可参考的理论依据。

材料与方法

1 试剂

胰腺癌Capan-1细胞购自于ATCC公司（编号：bio-69384）；抗ZNF488抗体、抗Cleaved-Caspase-3抗体、抗Bax抗体、抗vimentin抗体、抗PI3K抗体、抗p-PI3K抗体、抗AKT抗体、抗p-AKT抗体、抗GAPDH（内参蛋白）抗体购自于Abcam公司；抗E-cadherin抗体购自艾美捷科技有限公司；HRP标记的山羊抗兔IgG抗体购于美国CST公司；RPMI-1640培养基、10%胎牛血清、1%的青霉素/ 链霉素液、Lipofectamine 2000、购自Invitrogen公司；CCK-8试剂盒、胰蛋白酶、RIPA裂解液、BCA试剂盒、ECL化学发光试剂盒购自上海碧云天公司；对照siRNA（si-NC）和si-ZNF488序列购自上海吉玛公司；激动剂740Y-P（货号：HY-P0175）购自MCE（中国）公司。

2 细胞培养与转染

胰腺癌细胞Capan-1培养在含有10%的胎牛血清、1%的青霉素/链霉素液的RPMI-1640培养基中，并在条件为5% CO2和37 ℃的培养箱中培养。根据Lipofectamine 2000试剂操作说明书分别将si-NC、si- ZNF488转染Capan-1细胞，然后用25 nmol/L PI3K/AKT通路激活剂740Y-P处理被转染si-ZNF488的Capan-1细胞，胰腺癌Capan-1细胞被分为si-NC组、si-ZNF488组和si-ZNF488+740Y-P组。

3 CCK-8检测细胞增殖

取对数期的各组Capan-1细胞，制备单细胞悬浮液，按密度为2000/孔接种于96孔板中后，置于培养箱中培养；培养2～4 h（细胞贴壁）后，室温避光加入10 μL的CCK8试剂，在培养箱中避光孵育1～3 h，然后用酶标仪在波长为450 nm处检测吸光值。之后每天的同一时间点加入CCK-8试剂，避光孵育后检测OD值，共检测4 d。

4 流式细胞术检测细胞凋亡

收集各组对数生长期的Capan-1细胞，PBS洗涤细胞，胰蛋白酶消化细胞，离心后，弃上清，加入200 μL 1×Binding Buffer悬浮细胞，浓度调为1×106/mL，离心后弃上清，分别加入5 μL 的Annexin V-FITC与PI后，室温避光孵育20 min，利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

5 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭

收集各组对数生长期的Capan-1细胞，进行迁移和侵袭实验。迁移实验：PBS洗涤后用无血清培养基重悬细胞，在24孔板底部（下室）加入含10%FBS的RPMI-1640培养基，上室加入1×105个细胞，5%CO2和37 ℃的培养箱中培养24 h后，用多聚甲醛（4%）固定后结晶紫染色，显微镜下观察；侵袭实验在上室加入细胞之前，先在上室均匀的铺上100 μL的基质胶稀释液，随后培养箱培养1～4 h后再接种细胞，其余步骤与迁移实验相同。

6 Westren blot分析

收集细胞，加入RIPA裂解液裂解20 min后提取总蛋白，用BCA法检测蛋白浓度，之后用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳等量分离蛋白后转移至PVDF膜，用5%的脱脂奶粉封闭2 h（室温），加入ZNF488（1:1000）、Cleaved-Caspase-3（1:500）、Bax（1:500）、E-cadherin（1:500）、vimentin（1:1000）、PI3K（1:1000）、p-PI3K（1:1000）、AKT（1:1000）、p-AKT（1:1000）、GAPDH（1:1000）一抗后4 ℃过夜。次日用PBS洗膜后HRP标记的山羊抗兔IgG（1:2000）孵育后ECL显影、拍片，应用Image J软件对各蛋白条带光密度进行定量分析，以各目的蛋白光密度与内参蛋白GAPDH光密度比值代表各目的蛋白相对水平。

7 统计学分析

应用SPSS22.0分析实验数据，GraphPad 8.0制作图表，两组之间采用独立样本t检验，多组之间比较用单因素方差分析，每组重复3次，P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 ZNF488在胰腺癌中高表达并与总生存负相关

TCGA在线数据（http://ualcan.path.uab.edu/analysis-mir.html）分析结果显示，与正常组织相比，肿瘤组织中ZNF488的相对表达量显著增高（图1A），与ZNF488低表达组患者相比，ZNF488高表达组患者的生存时间较短（图1B）。

图1 胰腺癌中ZNF488表达及与总生存关系的TCGA在线数据库分析。*P＜0.05Fig. 1 TCGA online database analysis of relationship between ZNF488 expression and overall patient survival in pancreatic cancer. *P＜0.05

2 干扰ZNF488抑制胰腺癌细胞增殖并促进胰腺癌细胞凋亡

Western blot检测证明本实验所用si-ZNF488序列能有效干扰Capan-1细胞的ZNF488蛋白表达（图2A）。CCK-8检测显示：在转染后72 h时，si-ZNF488组的细胞增殖较si-NC组明显下降；si-ZNF488+740Y-P组的细胞增殖较si-ZNF488组有所增加，但仍低于si-NC组（图2B）。流式细胞术分析发现：si-ZNF488组的细胞凋亡率明显高于si-NC组；si-ZNF488+740Y-P组的细胞凋亡率明显低于si-ZNF488组，但仍高于si-NC组（图2C）。Western blot检测发现，si-ZNF488组的促凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3和Bax水平较si-NC组显著增加；si-ZNF488+740Y-P组Cleaved-Caspase-3和Bax显著低于si-ZNF-488组，但仍高于si-NC组（图2D）。这些结果说明干扰ZNF488的表达可显著抑制胰腺癌Capan-1细胞的增殖并促进细胞凋亡，而PI3K/AKT通路激活剂可阻断或减轻干扰ZNF488对Capan-1细胞增殖和凋亡的影响。

图2 干扰ZNF488对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响。A，Western blot 检测ZNF488干扰效率；A1，ZNF488水平代表性Western blot检测结果；A2，ZNF488水平统计学分析。B，CCK-8法检测细胞增殖。C，细胞凋亡率流式细胞术检测；C1，代表性流式细胞术检测结果；C2，细胞凋亡率统计学分析；D，Western blot 检细胞凋亡相关蛋白水平；D1，Cleaved-caspase-3 （C-Caspase-3）和Bax水平代表性Western blot 检测结果； D2，C-Caspase-3和Bax水平统计分析图。 *P＜0.05Fig. 2 Effect of interfering ZNF488 on proliferation and apoptosis of pancreatic cancer cells. A， Western blot detection for the knock-down efficiency of ZNF488; A1， representative Western blot result for ZNF488 expression level; A2， statistical analysis of ZNF488 level with Western blot detection. B， CCK-8 detection for cell proliferation. C， flow cytometry detection for cell apoptosis; C1， representative flow cytometry detection; C2， statistical analysis of flow cytometry results. D， Western blot detection for apoptosis-related proteins， D1， representative Western blot results for Cleaved-caspase-3 (C-Caspase-3) and Bax level; D2， statistical analysis of C-Caspase-3 and Bax level . *P＜0.05

3 敲低ZNF488抑制Capan-1细胞的迁移和侵袭

Transwell实验显示：si-ZNF488组Capan-1细胞迁移和侵袭能力较si-NC组显著下降；si-ZNF488+740Y-P组的迁移和侵袭细胞数较si-ZNF488组明显增加，略低于si-NC组（图3A、B）。Western blot检测表明：si-ZNF488组E-cadherin和vimentin水平较si-NC组显著降低和增高； si-ZNF488+740YP组的E-cadherin和vimentin水平较si-ZNF488组显著增高和降低，但略低于和略高于si-NC组。这些变化说明干扰ZNF488可显著抑制胰腺癌Capan-1细胞的迁移和侵袭，而PI3K/AKT通路激活剂逆转了干扰ZNF488对胰腺癌Capan-1细胞的迁移和侵袭的抑制作用。

图3 干扰ZNF488对Capan-1细胞迁移侵袭的影响。A1，Capan-1细胞迁移力的代表性Transwell检测结果；A2，Capan-1细胞迁移力的统计学分析。B1，Capan-1细胞侵袭力的代表性Transwell检测结果；B2，Capan-1细胞侵袭力的统计学分析。C1，EMT相关蛋白水平的代表性Western blot 检测；C2，EMT相关蛋白水平统计学分析图。*P＜0.05Fig. 3 Effect of interfering ZNF488 on migration and invasion of Capan-1 cells. A1， representative Transwell detection for Capan-1 cell migration; A2， statistical analysis of Capan-1 cell migration detected by Transwell. B1， representative Transwell detection for Capan-1 cell invasion; A2， statistical analysis of Capan-1 cell invasion detected by Transwell. C1， representative Western blot detection for EMT-related protein levels; C2， statistical analysis of EMT-related proteins detected by Western blot. *P＜0.05

4 敲低ZNF488下调Capan-1细胞PI3K/AKT通路相关蛋白水平

Western blot检测发现：si-ZNF488组的PI3K/AKT通路相关蛋白p-PI3K和p-AKT水平均显著下调； si-ZNF488+740Y-P组的p-PI3K和p-AKT水平均较si-ZNF488水平显著上调，但仍低于si-NC组。因此，ZNF488可通过PI3K/AKT通路发挥对Capan-1细胞的调控。

讨 论

胰腺癌是生存率较低、预后较差以及侵袭性较高的一种恶性肿瘤[10]。化疗和外科手术治疗是目前临床上治疗胰腺癌的主要手段[11]，然而传统的治疗手段对于胰腺癌患者的生存率并不理想[3]。因此寻找胰腺癌发生发展的作用机制非常重要。锌脂蛋白488（ZNF488）被证实是一种致癌基因，有研究表明ZNF488可通过调控Wnt/β-catenin/GSK3β通路促进肿瘤的发生和侵袭，诱导癌细胞的上皮间质转化[12]，同时也有研究表明，与低表达ZNF488的鼻咽癌患者比较，高表达ZNF488的鼻咽癌患者总生存期、局部区域无复发生存期以及无距离转移生存期较差[13]。然而近年来关于ZNF488的促肿瘤作用在鼻咽癌中的研究较多，而在胰腺癌中的作用机制还未见报道。本研究通过在线数据库发现ZNF488在胰腺癌患者组织中高表达，且ZNF488高表达的胰腺癌患者生存较差，同时本研究通过体外实验发现，敲低ZNF488可显著抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡，再次证明了ZNF488的促癌作用，并首次证实了ZNF488在胰腺癌中的促癌作用。

图4 干扰ZNF488对PI3K/AKT通路相关蛋白表达的影响。A，PI3K/AKT通路相关蛋白水平的代表性Western blot 检测；B，PI3K/AKT通路相关蛋白水平定量统计分析； *P＜0.05Fig. 4 Effect of interfering ZNF488 on the expression of PI3K/AKT pathway-related proteins. A， representative Western blot detection of PI3K/AKT pathway-related protein levels; B， statistical analysis of PI3K/AKT pathway-related proteins with Western blot detection; *P＜0.05

研究表明，PI3K/AKT信号通路可介导胃癌、食管癌等多种肿瘤的发生和发展[14-16]，研究已经证实，PI3K/AKT信号通路的失调在胰腺癌的发生和发展中同样具有重要的意义，例如，最新的研究发现miR-30d可通过调控SOX4的表达，进而调控PI3K/AKT信号通路影响胰腺癌的进程[17]；Li等[18]在研究中发现巨噬细胞来源的miR-365可通过激活PI3K/AKT信号通路促进胰腺癌的进展；这提示ZNF488在胰腺癌中的促癌作用可能通过PI3K/AKT信号通路实现的。本研究通过体外实验发现敲低ZNF488后，PI3K/AKT信号通路的相关蛋白p-PI3K和p-AKT的蛋白表达水平均下调，表明敲低ZNF488可通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制胰腺癌细胞的增殖和迁移侵袭。740Y-P为PI3K/AKT信号通路的激活剂，本研究发现740Y-P可逆转敲低ZNF488对胰腺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响，再次证明ZNF488可通过调控PI3K/AKT信号通路进而调控胰腺癌细胞的生物学行为。

综上，本研究首次证实ZNF488在胰腺癌细胞中的调控作用，并且明确了ZNF488在胰腺癌中通过上调PI3K/AKT信号通路相关蛋白水平进而发挥作用的调控机制，提示ZNF488有望成为胰腺癌靶向治疗的靶点，为胰腺癌的靶向治疗提供了新的参考依据。