响应面法优化海南砂仁多糖的提取工艺研究

符玉将，姜熙林，张 帅，吴秋香，邱 敏，屈慧娟，魏 娜

（海南医学院药学院，海南 海口570100）

多糖是一类天然产物的聚合物，具有与维持生命机能密切相关的多种药理活性，在抗肿瘤、抗感染、降血糖、降血脂、抗病毒以及抗氧化等方面具有独特的功效［1-6］。多糖因为其具有较多的作用，所以一些多糖已被作为治疗疾病的药物和保健食品来开发。海南砂仁为姜科豆蔻属植物海南砂仁（Amo⁃mum longiligulare T.L.Wu）的干燥成熟果实，主要产于海南澄迈、陵水等县，是海南特有的品种，已有1 300 多年的使用历史；砂仁味辛、性温，具有化湿开胃、温脾止泻、理气安胎的功效，黎族地区人们经常用其果实煎汤以治疗消化不良［7，8］。近年药理研究也表明砂仁可以发挥调节胃肠动力、免疫系统、镇痛消炎、抗氧化等作用［9-11］。虽然海南砂仁和阳春砂仁同为药典规定的正品砂仁，但国内外对砂仁的研究却主要集中在阳春砂仁上，并发现了阳春砂仁在免疫调节及肠道菌群的调控方面活性显著［12-15］，而且它还可以不同程度的抑制大肠杆菌、沙门氏菌和葡萄球菌等［16］。但有关海南砂仁尤其是其多糖的文献研究却少有报道，因此本研究采用超声辅助法提取海南砂仁多糖［17，18］，采用单因素试验和响应面法分析优化海南砂仁多糖的提取工艺，目的是为海南砂仁的合理开发和利用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用药材来自海南琼中，并在海南医学院药学院经过曾念开教授鉴别确认是豆蔻属植物海南砂仁Amomum longiligulare T.L.Wu 的果实；无水乙醇（分析纯），由西陇科学股份有限公司生产。

1.2 仪器与设备

LYSF-200-B 超高速多功能粉碎机（长沙市桌成医疗器械有限公司）；HH-6 数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）；DZF-6020 真空干燥箱（上海申贤恒温设备厂）；SY-180 超声波清洗机（上海宁商超声仪器有限公司）；80-3 电动离心机（金坛区西城新瑞仪器厂）；ML203 电子天平（MTD（中国上海）。

1.3 试验方法

1.3.1 海南砂仁的前处理 取海南砂仁干燥成熟果实于超高速多功能粉碎机中粉碎，所得粉末全部经过药典3 号筛，密封好备用。

1.3.2 海南砂仁多糖的提取 海南砂仁粉末3 g，按15∶1 液料比加纯净水，于180 W 功率，60 ℃下，超声提取30 min，过滤，再使用纯净水对所得滤渣以同样的方法提取3 次，合并滤液后离心，取上清液，浓缩至原来体积的1/4，加无水乙醇至醇浓度为80%，4℃下静置24 h，抽滤，沉淀依次使用无水乙醇和丙酮清洗，真空干燥，称重［19-21］。计算多糖得率的公式如下：

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 提取时间对海南砂仁多糖得率的影响 称取5 份海南砂仁粉末各3 g，将提取次数、水浴温度、液 料 比 分 别 固 定 为2 次、60℃和20∶1，然 后 采 用“1.3.2”项下的方法分别探究提取时间（10、20、30、40、50 min）对海南砂仁多糖得率的影响。

1.3.3.2 提取温度对海南砂仁多糖得率的影响 称取5 份海南砂仁粉末各3 g，将提取次数固定为2 次，提取时间设置为30 min，液料比保持20∶1 不变，然后采用“1.3.2”项下方法分别探究提取温度（40、50、60、70、80 ℃）对海南砂仁多糖得率的影响。

1.3.3.3 液料比对海南砂仁多糖得率的影响 称取5 份海南砂仁粉末各3 g，提取次数被固定为2 次，提取时间设置为30 min，提取温度保持60 ℃不变，同理采用“1.3.2”项下方法分别探究液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1）对海南砂仁多糖得率的影响。

1.3.3.4 提取次数对海南砂仁多糖得率的影响 称取5 份海南砂仁粉末各3 g，使提取时间固定为30 min，提取温度保持为60 ℃不变，液料比固定为20∶1，同理使用“1.3.2”项下方法分别探究提取次数（1、2、3、4、5）对海南砂仁多糖的影响。

1.3.4 响应面优化设计 基于单因素试验的结果，利用Box-Behnken 中心组合实验设计的原理，将超声时间、提取次数、提取温度和液料比选取为影响因素，采用Design Expert 10 软件进行响应面优化设计，并对试验所得的数据进行多次二项回归拟合［22］。以多糖得率为响应值，回归方程中各变量对该指标（响应值）影响的显著性，采用F 检验判定，概率P（F＞F0）的值越小，则响应变量的显著程度越高［23］。各个影响因素与响应值存在的密切关系能够很好地被回归方程所描述，故可利用其去确定影响海南砂仁多糖得率的4 个自变量的显著性，并根据实际情况选出最佳的提取工艺条件。然后按照最佳工艺条件平行进行3 次实验，最后将实验所得结果与预测值作比较，以此来验证回归方程的可行性和有效性。

2 结果

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取时间对海南砂仁多糖得率的影响 在10～30 min 期间，可以观察到随着提取时间的增加，海南砂仁多糖的提取率也随之升高，并且其峰值出现在30 min，但继续延长提取时间反而导致海南砂仁多糖得率出现明显的下降。推断其原因，可能是因为超声时间延长导致某些水溶性多糖的结构遭到破坏［24］。故选择最佳提取时间为30 min，见图1A。

2.1.2 提取次数对海南砂仁多糖得率的影响 由图可知，多糖得率在提取次数为4 次时达到峰值。提取次数为1～4 次时，海南砂仁的提取率随提取次数的增多逐渐升高，当提取次数达第5 次时，海南砂仁多糖得率反而下降，故确定提取次数为4 次，见图1B。

2.1.3 提取温度对海南砂仁多糖得率的影响 当超声温度在40 ℃～70 ℃这个区间时，多糖得率与温度呈正相关关系，温度为70 ℃出现峰值。推测其原因可能是在一定范围内温度的升高使溶液黏稠度降低，利于多糖的溶出，但当温度超过70 ℃时，可能是温度过高使多糖降解［25］。因此确定提取温度为70 ℃，见图1C。

2.1.4 液料比海南砂仁多糖得率的影响 由图可知，在液料比由10∶1 升高至15∶1 时，多糖得率显著升高，之后随液料比不断增加多糖得率反而逐渐下降。可能是因为海南砂仁多糖在水中的溶解度是有限的，因此多糖得率的峰值出现在其溶解度达到饱和的时候。但随液料比继续增加，可能导致部分多糖重新溶解，造成多糖浓度降低，因此确定液料比为15∶1，见图1D。

图1 单因素对多糖得率的影响Fig 1 The influence of single factor on polysaccharide yield

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验因素和水平的确定 响应面分析试验的因素和水平确定是基于单因素试验的结果。见表1。

2.2.2 响应面试验设计与结果 基于单因素试验的结果分析，利用Box-Behnken 的中心组合试验设计原理，使用Design Expert 10 软件对提取次数、提取温度、提取时间和料液比这4 个因素进行响应面优化设计。见表2。

2.2.3 回归方程的建立与显著性检验 拟合全变量二次回归方程的模型的建立是使用Design Ex⁃pert 10 软件进行多项式回归分析所得出。所得回归方程的模型为：

表1 因素及水平编码表Tab 1 Factor and level coding table

表2 响应面试验设计及结果Tab 2 Response surface experiment design and results

对该模型进行方差分析见表3。通过统计学分析可知，该模型P 值＜0.01，表明回归模型极显著，方差的失拟项P 值为0.077 8，大于0.05 表明模型的失拟项不显著，实验误差小。所选模型的R2=0.943 4，R2Adj=0.886 9，说明该模型与实验拟合较好，故对海南砂仁多糖提取工艺条件进行优化是可以使用这个模型。

表3 回归模型方差分析结果Tab 3 ANOVA results of regression model

2.2.4 最佳工艺参数的确定 基于响应面分析优化所得的结果，回归方程模型给出海南砂仁多糖的最佳提取条件为提取时间29.08 min，提取次数3.68次，提取温度68.04 ℃，液料比15.47∶1（mL/g），并且其预测在此工艺条件下海南砂仁多糖得率为10.90%。根据实际操作情况及生产成本，修改最佳提取工艺条件为：提取时间29 min，提取次数3 次，提取温度68℃，液料比15∶1（mL/g）。在此条件下进行了3 次平行验证实验，并对3 次实验结果进行统计分析。结果表明海南砂仁多糖的平均得率为10.69%，与预测值10.90%较为相近，且相对误差在可接受的范围内，说明此模型可有效预测海南砂仁多糖得率。

2.2.5 响应曲面及等高线分析结果 在用超声辅助海南砂仁多糖的提取流程中，可较为直观看到提取时间、提取次数、提取温度和液料比这4 个因素之间的相互作用影响多糖的得率，并且各因素交互作用的显著程度也可以下6 图可直观反映（图2A～F）。响应面图中曲线越弯曲表明该因素对多糖得率影响越大，而等高线呈椭圆形说明所选研究因素之间的交互作用显著，呈圆形时则表示交互作用不显著［26-28］。

根据图2A 可知，随提取温度升高或提取次数增多，同时也伴随着多糖得率的升高，但当多糖得率出现峰值后，再升高提取温度或增加提取次数，多糖得率反而降低。由于等高线呈现圆形，表明提取温度和提取次数这两个因素的交互作用不显著；同时观察到响应曲面坡度较为陡峭，这说明提取温度和提取次数这两个因素对海南砂仁多糖得率的影响较大。

根据图2B 可知，在一定液料比下，多糖得率在提取温度40 ℃～70 ℃的区间内随温度的升高而升高，超过这个区间就趋于平稳。同时又可以从等高线趋于椭圆形得出提取温度和液料比这两个因素的交互作用显著；根据响应面两侧的弯曲程度，位于提取温度一侧的弯曲程度较陡，所以液料比对海南砂仁多糖得率的影响程度小于提取温度。依据图2C 的等高线形状及响应面两侧弯曲程度，表明料液比和提取次数之间存在显著的相互作用，而且对多糖得率影响而言，提取次数的影响程度大于液料比。由图2D 可知，提取时间对多糖得率的影响程度小于提取温度，并且它们之间存在的交互作用对多糖得率产生显著影响。

根据图2E 可以看出，当固定提取时间时，随提取次数增加，多糖得率呈先升高后降低的趋势；而当提取次数一定时，随提取时间的延长，多糖得率无明显变化。依据等高线和响应面坡度的形状，表明提取时间和提取次数之间存在较为显著的交互作用，对多糖得率的影响程度，提取时间小于提取次数。同理可知图2F 中提取时间和液料比之间存在的交互作用不显著，而且对多糖得率的影响都比较弱。

图2 各因素交互作用对多糖得率影响的响应曲面图Fig 2 Response surface graph of the interaction of various factors on the yield of polysaccharides

3 结论

本试验以海南砂仁为原料，采用超声辅助提取法提取，并使用水提醇沉法制取砂仁多糖，然后结合分析单因素试验的结果，利用Design Expert 10 软件对提取工艺条件进行响应面优化分析，构建了所选的4 个影响因素与海南砂仁多糖得率之间的数学模型关系式，并依据实际生产情况最终把最佳提取工艺条件确定为：超声功率180 W，超声时间29 min，提取次数3 次，提取温度68oC，液料比15∶1，该条件下多糖得率实际值为10.69%。该优化方案提取时间短，多糖得率高，有效可行，具有较高的实用价值。本文对海南砂仁多糖的开发及利用研究提供一定的理论基础，并对海南砂仁将来的应用前景具有一定的指导意义。