胰高血糖素样肽1 对巨噬细胞内基因ACAT1、CD36 的表达及胆固醇代谢的影响

岳云飞，韩永魁，张 奎，申晓彧

（山西医科大学第二临床医院，山西太原030000）

巨噬细胞内胆固醇的代谢紊乱及蓄积量过多会导致其泡沫化，泡沫细胞内有着大量的脂肪，是动脉斑块形成的一大因素，而巨噬细胞内胆固醇的代谢紊乱及蓄积量过多会导致其泡沫化，对于动脉粥样硬化的发生发展起了重要作用［1，2］。已有资料表明，在巨噬细胞的细胞膜表面，CD36 可以和氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）相结合，并在此前提下进一步促进了单核巨噬细胞转变为泡沫细胞的过程，是 动 脉 粥 样 硬 化 形 成 的“ 罪 犯 因 子”之 一［3］。ACAT1 对游离胆固醇具有催化作用，使其转化为胆固醇酯，因此ACAT1 与CD36 在对胆固醇在细胞内的代谢中同样起着关键性的作用［4］。且都能够加剧细胞内胆固醇的蓄积，加快动脉粥样硬化的发生速率。部分研究发现，人体内GLP-1 的分泌场所主要来源于小肠中的L 细胞，有2 种生物活性形式，其中之一为GLP-1（7-36a），GLP-1 约80%的活性来自7-36a；另一种活性形式为GLP-1（7-37），其酰胺化产物为GLP-1（7-36a）。有大量研究发现，GLP-1对人体具有多种益处，在对心血管层面则起着抑制动脉粥样硬化发展的作用，但其分子机制及通路尚未完全明确［5，6］。在动物组织学层面已得到证实［7］，GLP-1 类似物能够减少主动脉根部斑块面积，从而抑制动脉粥样的发展过程，本研究旨在从细胞学角度进一步观察GLP-1 能否降低ACAT1 与CD36 的表达，并通过检验细胞内胆固醇的含量来进一步验证GLP-1 在人体内能够通过抑制ACAT1 与CD36的表达，从而减少细胞内胆固醇的蓄积，最终起到延缓动脉粥样硬化发生发展的具体过程，并为延缓动脉斑块的形成提供新的治疗思路。

1 材料与方法

1.1 药物

GLP-1（7-36）货号：249125，由上海吉尔生化有限公司生产，GLP-1（7-36）抑制剂［（Exendin（9-39）］货号：055285，由上海吉尔生化有限公司生产。

1.2 试剂

Raw264.7 小鼠单核巨噬细胞白血病细胞、辣根过氧化物酶标记二抗（武汉博士德生物工程有限公司）；ox-LDL（北京协生生物科技有限公司）；ACAT1 一抗（武汉三鹰生物有限公司）；CD36 一抗（上海拜力生物科技有限公司）；PCR 试剂盒［宝日医生物技术（北京）有限公司］。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养和分组 取小鼠来源的巨噬细胞，并置于37℃、5%CO2条件下进行培育，将其浓度调整为适宜浓度，接种于6 孔培养板，加用RPMI-1640 培养液，饥饿培育1 h 单核细胞，再加入50 mg/L 的ox-LDL 将巨噬细胞诱导为泡沫细胞，而后加入5 nmol/L 的GLP-1（7-36），然后将细胞分为4 组：空白对照组（巨噬细胞）、实验组（将巨噬细胞诱导成的泡沫细胞）、GLP-1 激动组（在泡沫细胞的基础上加 入GLP-1）、GLP-1 抑 制 组［GLP-1 及 其 抑 制 剂Exendin（9-39）］。

1.3.2 油红O 染色 将浓度为50 mg/L 的ox-LDL滴入巨噬细胞对其进行干涉处理24 h，60%异丙醇润洗，每孔各1 次，各孔内加入1 mL 油红O 染色15 min，再用苏木精染色2 min，干预后的细胞泡沫化状况及形态用倒置显微镜察看。

1.3.3 RT-PCR 检测细胞中的ACAT1 和CD36 mRNA 表达 按照试剂盒法提取总RNA，进行逆转录及PCR 扩增，首先，在94℃下预变性3 min，然后再按照变性、退火的顺序进行40 次循环。ACAT1 上 游 引 物：5'-ACGTAATGAGCAGAG⁃GAGCAACAC-3'，下 游 引 物：5'-CGTATCCT⁃GTTCCTGCCGTGAG-3'；CD36 上 游 引 物：5'-CTTTGAAAGAACTCTTGTGGGG-3'，下 游 引物：5'-GTCTGTGCCATTAATCATGTCG-3'；β肌动蛋白（β-actin）上游引物：5'-CGAGCUCAAGC⁃GAUUUCCUCGUAU-3'，下游引物：5'-AGCTCC⁃GTCTATGGTGGTGGCTAT-3'；内参为β-actin。

1.3.4 Western blot 法检测各组细胞中CD36 和ACAT1 蛋白表达 将巨噬细胞诱导转化成为泡沫细胞并对其进行相应的处理之后，使用裂解液提取细胞内总蛋白，并用BCA 法对提取出的蛋白行定量分析。行凝胶电泳、浓缩电泳和分离电泳，再通过湿转法完成转膜，之后用牛奶封闭2～4 h。一抗在温度为4℃条件下以（1∶1 000）孵育过夜。漂洗3次，二抗（1∶2 000）在室温下孵育2 h。漂洗3 次，实验结果用凝胶成像系统进行收集，并测定条带灰度值，将内参基因设定为β-actin。

1.3.5 高效液相色谱法测定细胞内各胆固醇水平 将各组干预后的细胞，参考胆固醇测定试剂盒说明书，在酶标仪仪器发射波长为590 nm 处检测荧光值，游离胆固醇可以直接被检测出；胆固醇的测量需要在胆固醇酯酶的处理下检测；胆固醇酯的测量则为胆固醇与游离胆固醇的差值，单位为mg/mL。

1.4 统计学处理

结果采用SPSS23.0 统计软件处理分析，计量资料均以（±s）来进行表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 油红O 染色

用ox-LDL 对巨噬细胞行干涉处理后，对其行油红O 染色，并在镜下察看结果，其形态饱满，在细胞内能够观察到大量的脂滴颗粒后，可以确信泡沫细胞（巨噬细胞来源）的模型已成功建立。

2.2 各组CD36 和ACAT1 mRNA 表达比较

与空白对照组比较，实验组的CD36 和ACAT1 mRNA 表达显著上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；与实验组比较，GLP-1 激动组CD36 和ACAT1 mRNA 表达明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与GLP-1 激动组比较，GLP-1 抑制组CD36 和ACAT1 mRNA 表达明显上升，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组ACAT1 和CD36 mRNA 表达比较（n=8，±s）Tab 1 Comparison of ACAT1 and CD36 mRNA expression between the experimental groups and the blank control group（n=8，±s）

表1 各组ACAT1 和CD36 mRNA 表达比较（n=8，±s）Tab 1 Comparison of ACAT1 and CD36 mRNA expression between the experimental groups and the blank control group（n=8，±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与实验组比较，#P＜0.05；与GLP⁃1 激动组比较，▲P＜0.05。

CD36 mRNA 0.49±0.08 1.02±0.26 *0.52±0.08#0.97±0.14▲组别空白对照组实验组GLP⁃1 激动组GLP⁃1 抑制组ACAT1 mRNA 0.53±0.08 1.01±0.17*0.62±0.18 0.92±0.23▲

2.3 各组ACAT1 和CD36 蛋白表达比较

与空白对照组比较，实验组CD36 和ACAT1蛋白表达明显上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；与实验组比较，GLP-1 激动组CD36 和ACAT1 蛋白表达明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与GLP-1 激 动 组 比 较，GLP-1 抑 制 组CD36 和ACAT1 蛋白表达明显上升，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2 及图1。

表2 各组ACAT1 和CD36 蛋白表达比较（n=8，±s）Tab 4 Comparison of ACAT1 and CD36 mRNA expression level between blank control group and experimental groups（n=8，±s）

表2 各组ACAT1 和CD36 蛋白表达比较（n=8，±s）Tab 4 Comparison of ACAT1 and CD36 mRNA expression level between blank control group and experimental groups（n=8，±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与实验组比较，#P＜0.05；与GLP⁃1 激动组比较，▲P＜0.05。

CD36 蛋白0.55±0.14 1.01±0.21*0.56±0.12#0.99±0.10▲组别空白对照组实验组GLP⁃1 激动组GLP⁃1 抑制组ACAT1 蛋白0.55±0.07 0.98±0.09*0.65±0.15#0.91±0.24▲

图1 各组CD36 、ACAT1 的蛋白相对表达量比较Fig 1 The relative expression level of CD36 and ACAT1 proteins in each group

2.4 各组胆固醇水平比较

与空白对照组比较，实验组TC、FC、CE 水平均上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；与实验组比较，GLP-1 激动组TC、FC、CE 水平均明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与GLP-1 激动组比较，GLP-1 抑制组TC、TC、CE 水平均明显上升，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 各组胆固醇表达比较（n=8，±s）Tab 3 Comparison of cholesterol expression level between experimental group and blank control group（n=8，±s）

表3 各组胆固醇表达比较（n=8，±s）Tab 3 Comparison of cholesterol expression level between experimental group and blank control group（n=8，±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与实验组比较，#P＜0.05；与GLP⁃1 激动组比较，▲P＜0.05。

CE 6.55±1.01 50.87±0.56*10.36±0.65#35.84±0.78▲组别空白对照组实验组GLP−1 激动组GLP−1 抑制组TC 20.22±0.99 81.43±0.87*29.21±0.65#59.29±0.84▲FC 13.47±0.02 30.60±0.31*18.99±0.65#23.44±0.06▲

3 讨论

细胞中胆固醇代谢主要包括胆固醇的摄取和酯化以及流出等过程［8］，整个过程在正常情况下都会受到严格的调控，从而维持巨噬细胞内脂质水平的正常。若是摄取和酯化过程遭到干扰，导致调控能力下降，则可引起巨噬细胞内持续高胆固醇水平。过高的胆固醇水平会使巨噬细胞朝泡沫细胞进行转化，致使动脉粥样硬化的发展过程进一步加快［9］。在ox-LDL 摄取过程中，当CD36 特异性结合ox-LDL 后，其13-羟基十八碳二烯酸和9-羟基十八碳二烯酸被释放出，并通过丝裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶B 以及蛋白激酶C 等路径使氧化物酶增殖活化受体γ 被激活，被激活后的氧化物酶增殖活化受体γ 再进一步与视黄醇受体结合，开始了CD36 mRNA 的转录过程，进而使CD36 表达上调，CD36表达上调又进一步增加对ox-LDL 的摄取，且此反应不受负反馈的调节［10，11］。据相关文献报道，先天性CD36 缺乏的患者，其发生动脉粥样硬化发生的概率相较正常人而言相对处于较低水平。另有研究发现［12］，在高脂血症患者的体内，其外周血中CD36mRNA 的表达量也会远高于正常人。在胆固醇合成较高会导致细胞内胆固醇大量蓄积，使其代谢失衡，而作为此合成过程的关键酶，ACAT1 则能够 有 效 的 调 节 细 胞 内 的 胆 固 醇 水 平［13，14］。ACAT1与ACAT2 同属ACAT 的两个亚型，前者高表达于巨噬细胞内，而后者则主要表达在小肠中［15］，参与脂蛋白加工过程。有关研究发现，ACAT1 在巨噬细胞内可以将游离胆固醇合成为胆固醇酯，当血脂较高时，巨噬细胞胆固醇酯会处于高水平状态，在此水平下，巨噬细胞泡沫化发展进程也会逐步加快。

本研究中实验组中CD36 、ACAT1 mRNA 和蛋白的表达水平及TC、FC、CE 的含量均高于空白对照组，这表明CD36 与ACAT1 在巨噬细胞内表达与泡沫化程度呈正相关。因此是否可以通过药物作用于CD36、ACAT1 靶点，并降低其表达，从而减少巨噬细胞内胆固醇含量，并起到抑制巨噬细胞泡沫化成为本实验的主要研究目的。在本实验中，GLP-1 激 动 组 中CD36 、ACAT1 mRNA 和 蛋 白 的表达水平及其胞内的TC、FC、CE 的含量要低于实验组，进一步证明GLP-1 可通过下调ACAT1、CD36 表达来降低细胞内胆固醇水平。尤其是对于患有2 型糖尿病的动脉粥样硬化症患者，可以更好的降低心血管病风险［16，17］。有研究证实［18］，GLP-1类似物与其受体相结合后，可以起到增强胰岛素分泌、降低胰岛素抵抗等降糖作用，亦可使冠心病病人从中获益。此外，GLP-1 激动剂还能够起到独立于降糖作用以外的抗动脉粥样硬化作用［19］，减少冠脉的斑块面积。一项Mate 分析表明，GLP-1 受体激动剂还能够降低缺血性脑卒中的发生风险［20］。

综上所述，GLP-1 对于人体多个系统均有益处，本研究在冠脉粥样硬化方面发现，GLP-1 受体激动剂可以减少巨噬细胞内CD36、ACAT1 mRNA和蛋白得表达水平，减少胆固醇的摄取及合成，从而减少巨噬细胞内胆固醇蓄积，并阻止其泡沫化，达到抑制动脉粥样硬化发生发展的目的，降低心血管疾病风险。所以，应用GLP-1 类似药物来针对CD36、ACAT1 这两个靶点对动脉粥样硬化进行预防具有重要意义。