基于网络药理学和分子对接探讨培元补肾安胎方治疗复发性流产的作用机制

奚 婷，刘雁峰，包晓霞

（北京中医药大学东直门医院，北京100700）

复发性流产是女性妊娠期常见疾病，是指连续2 次或2 次以上在妊娠28 周之前的胎儿丢失，在育龄期女性中发病率达0.5%～3%［1，2］。受社会经济的快速发展、生活环境的改变、工作压力的增加等多方面因素的影响，发病率逐年增多［3，4］。随着中国二胎政策的放开，具有生育需求的家庭进一步增加，然而复发性流产的高发病率严重影响患者的身心健康和家庭的和谐，目前正逐渐成为一项社会问题。复发性流产不仅只意味着生育力下降，调查发现随着流产次数的增加，女性患缺血性卒中［5］、缺血性心脏病、冠心病等循环系统疾病［6，7］、后代神经系统疾病［8］等发病风险增加。目前研究发现染色体异常、子宫因素、内分泌异常、男性精子异常等均可导致复发性流产［9-12］，然而仍有50%～60%的病因不明［13］。用于复发性流产药物治疗主要是激素补充治疗（孕酮、甲状腺激素等）［14］、免疫调节治疗（免疫球蛋白、环孢素等）［15］、抗凝血治疗（阿司匹林、肝素等）［16］，部分患者还接受手术治疗，如宫颈环扎术、宫腔粘连分离术等［17］。然而通过系统的筛查病因和相应治疗后，仍有50%患者无法成功妊娠，且目前这些化学及生物药物治疗方法存在较多的不良反应，如过敏、出血、头疼及胃肠道反应等。近期研究发现免疫疗法可改善不明原因复发性流产的妊娠结局［18］，然而其治疗范围还有所限制，且其安全性还需要进一步明确。因此，需要一种更加安全、有效的治疗复发性流产的方法。

中医药在多种疾病的治疗中已经使用了数千年，且中医药具有价格便宜、疗效好且大部分中药来自天然的植物或动物等，副作用少等优点。在整体观念的指导下，通过辨证论治，中医药已成为被广泛接受的一种安全有效的复发性流产的治疗方法。近年来大量的临床研究报道证明了中医药治疗复发性流产的有效性。复发性流产在中医学中称为“滑胎”。中国清代名医张锡纯创建的寿胎丸是治疗滑胎、防治先兆流产的经典方，临床中广泛应用，且进行了大量的临床和实验研究，meta 分析结果提示在先兆流产的治疗中，寿胎丸的疗效优于单纯西药［19］。

培元补肾安胎方是刘雁峰教授在结合治疗复发性流产的长期临床实践经验和前人经验方“寿胎丸”的基础上创建，基于“脾肾不足，胎元不固”的病机，以培元补肾、益气安胎为治法。培元补肾安胎方是在寿胎丸基础上增加白术、黄芪、党参、黄芩、炙甘草、白芍6 味中药而成。方中桑寄生、续断、菟丝子补肾，党参、黄芪、白术健脾益气，黄芩清热，白芍柔肝，甘草调和诸药。前期临床研究证实补肾安任法能改善复发性流产患者再次先兆流产的中医证 候 积 分，改 善E2、P、HCG 水 平，提 高 妊 娠 成 功率［20，21］。然而培元补肾安胎方含有多种活性成分，这些给它的药效物质基础研究，治疗复发性流产作用靶点以及分子机制研究带来很大的困难。网络药理学作为一种新兴药物的研究方法，可以帮助获得中药复方的主要活性成分，筛选出药物作用的核心靶标和参与的主要通路，从系统水平上研究药物、基因等生物学过程。本文利用网络药理学来逐渐发现和了解培元补肾安胎方的治疗复发性流产的机制。

1 材料与方法

1.1 培元补肾安胎方活性化合物的筛选

培元补肾安胎方由桑寄生、续断、菟丝子、党参、黄芪、黄芩、白术、白芍、甘草这9 味中药组成。通 过 检 索TCM（http：//tcm.cmu.edu.tw/）、TC⁃MSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）数据库，收集培元补肾安胎方方中各单味药的主要化学成分。考虑中药成分复杂，并非所有成分均被吸收，结合文献及平台推荐，设置条件参数口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18 初步筛选出该复方潜在的活性成分［22，23］。

1.2 预测化合物所对应的靶基因

通过TCMSP、pubchem、CHEMBL 逐一对比得到培元补肾安胎方潜在化合物对应的作用靶点。然后，利用Uniport（蛋白质数据库）（https：//www.uniprot.org/）获得与潜在活性成分相关的靶点蛋白信息，对潜在靶点进行标准化，筛选来自人类属性的靶点基因。

1.3 复发性流产的疾病靶点

通过人类基因组注释数据库（Genecard⁃shttps：//www.genecards.org/）和 人类孟德尔遗传数据库（OMIMhttps：//www.omin.org/），设置检索词为“Recurrent spontaneous abortion or RSA”，获得与复发性流产相关的已知靶基因信息。

1.4 药物-化合物-靶点网络的构建

利用R 语言将疾病靶基因与培元补肾安胎方化合物潜在作用靶点进行对比取交集，绘制韦恩图，得到培元补肾安胎方治疗复发性流产的潜在作用靶点，用于后续研究。将培元补肾安胎方的潜在活性成分与其潜在靶点蛋白上传至cytoscape3.6.1软件（https：//www.cytoscape.org/）构建体现药物-化合物-作用靶点的相互作用网络图，以探究培元补肾安胎方的药理学作用机制。

1.5 靶点蛋白相互作用网络构建

将上述得到的培元补肾安胎方治疗复发性流产的潜在靶点导入string 数据库（https：//string-db.org），属性限定“Homo sapiens”，获得靶蛋白之间的相互作用关系，得到PPI 网络图，并且利用R 语言软件统计出现频次并绘制柱状图。

1.6 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析

clusterProfiler 是Bioconductor 的 软 件 包，可 以对基因集合进行功能的聚类统计和可视化分析。本研究应用clusterProfiler 包对药物与疾病的共同靶点进行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，并将富集结果以气泡图或条形图等形式可视化。利用R 语言构建核心通路的靶基因的位置，以便研究培元补肾安胎方治疗复发性流产的可能的作用机制和涉及的通路。

1.7 分子对接

为了进一步验证本研究的可靠性，通过MOE软件进行分子对接来评估培元补肾安胎方重要活性成分与关键靶点之间的结合活性。本文药效特征注释采用的是EHT（Extend Huckel theory）方式。为了准确评估预测目标，蛋白结构在对接之前需要对蛋白结构进行预处理，因为蛋白结构解析的时候会存在结构缺失，原子的局部电性没有标出，没有明确水分子的位置，以及氢原子的位置信息，首先从RCSB Protein Data Bank（http：//www.pdb.org/）下载PPI 网络中前10 的核心靶点蛋白结构，然后通过MOE（2015）的Structure Preparation 查找并解决相应的问题，主要包括优化和修补氨基酸，重新移动水分子，计算局部原子的电性，最后通过Proton⁃ate3D 进行加氢质子化，优化氢键结构，最后利用LigX Panel 对整体结构再次优化，包括化合物的结构式和能量最小化，以MOE 格式保存，最后通过Dock 计算，将预测的药效团特征与前10 个目标化合物分子拟合。利用MOE 中Dock 功能进行模拟计算的时候配体分子的模式设置为柔性对接，确保寻找到最优分子结构，选择经典小分子对接函数Triangle Matcher 进行计算，最后根据London dG 评分准则对结果进行打分。当Docking Score 绝对值＞4.25 表示分子与靶点具有一定的结合能力，＞5.0表示结合能力较强，＞7.00 表示结合能力很强［24］。

2 结果

2.1 培元补肾安胎方的化合物筛选及预测靶点

本研究运用中药网络药理学数据库TCMSP、TCM 数据库最终收集到培元补肾安胎方中这9 味药所含的化合物共810 个，其中桑寄生46个，续 断31 个，菟 丝子29 个，党参134 个，黄芪87个，黄芩143 个，白术55 个，白芍5 个，甘 草280 个。通过标准参数OB≥30%，DL≥0.18 对其所有化合物进行筛选并去重，最终得到培元补肾安胎方潜在化合物186 个，见表1。共获得1 339 个化合物作用靶点，去除重复的1 299 个，得到药物共有的136 个成分靶点。

2.2 复发性流产的疾病靶点筛选

通过检索Genecards、OMIM 数据库得到复发性流产的疾病靶点，其中Genecards 数据库以score值≥30 为限制条件进行筛选.经过去重共得到1 658 个。

2.3 共同靶点筛选及化合物−作用靶点互作网络构建

利用R 语言将疾病靶点与药对活性成分对应的136 个靶点作对比，绘制韦恩图，获得共同靶标65个，即培元补肾安胎方对复发性流产的预测作用靶标，见图1。将药物化合物与共同靶点导入cyto⁃scape3.6.1 软件中，绘制“化合物-靶点”图，见图2。由于MOL000379、MOL004990 等化合物在数据处理过程中未查及相关作用靶点，故将其剔除。网络中化合物节点145 个，作用靶点节点65 个，网络中共有210 个节点，1 671 条边，每条边表示化合物与靶点直接的关系；度值表示连接该节点的条数，度值越大，表示该节点与其他节点的相互作用越广泛，在网络中起到枢纽作用。化合物中度值前10 的是kaempferol、quercetin、beta-sitosterol、isorhamne⁃tin、luteolin、formononetin、7-Methoxy-2-methyl iso⁃flavone、baicalein、Calycosin、wogonin 等。65 个潜在靶点分别至少与两个化合物相连接，说明多种化合物均有多个共同的作用靶点，提示了中药多成分、多靶点、多途径的作用模式。

图1 复发性流产与培元补肾安胎方共同靶点韦恩图Fig 1 Venn diagram of the common targets of recurrent abortion and Peiyuan Bushen Antai formula

图2 化合物-靶点图Fig 2 Compound-target diagram

2.5 PPI 网络的构建和关键靶点的提取

机体的调节不是由单一的信号途径主导，而是存在不同的信号通路和靶点的复杂的调节网络。PPI 运作大规模的生物过程，例如蛋白间相互作用，代谢控制和发育控制。因此运用PPI 分析可以可视化分析潜在靶点直接的相关作用，有助于挖掘核心的调控基因。将65 个靶点基因输入string 数据库，获得PPI 网络，网络中有65 个节点，含有610 条边，节点度数平均为18.8，见图3。利用R 语言软件统计出频次前30 靶点并绘制条形图，图中可知VEG⁃FA（47），IL6（46），EGFR（43），MAPK8（41），ESR1（39）等是整个核心蛋白，说明在复发性流产的治疗中，培元补肾安胎方可能通过这些蛋白发挥治疗作用，见图4。

2.6 GO 功 能 和KEGG 通 路 富 集

应用clusterProfiler 对共同靶点进行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析。GO 功能主要涉及转录因子活性、类固醇激素受体活性、类固醇结合、氧化活性、抗氧化活性、单加氧酶活性等生物学过程，体现了培元补肾安胎方可能调控多个复杂的生物学过程来治疗复发性流产，GO 分析的前20 个条目，见图5。对共同靶点进行KEGG 通路富集分析，通过设置p-value＜0.05，q-value＜0.05 的条件共得到62条信号通路。经分析，62 条富集通路主要是信号传导相关通路（PI3K-Akt、MAPK、P53、凋亡等通路）、疾病通路（乙型肝炎、EB 病毒感染、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、前列腺癌等通路）等。利用R 语言软件对前20 条主要富集的通路进行可视化处理，见图6。大多数基因主要富集在癌症信号通路（15个、图7）、P53 通路（9 个、图8）。通路上靶点基因越多，提示培元补肾安胎方可能通过调控该信号通路从而起到治疗作用。

图3 65 个潜在作用靶点PPI 网络图Fig 3 Protein-protein interaction（PPI）network diagram of 65 potential targets

图4 前30 个潜在作用靶点条形图Fig 4 Bar chart of the top 30 potential targets

图5 GO 功能富集分析Fig 5 GO functional enrichment analysis

2.7 分子对接

图6 前20 个KEGG 通路气泡图Fig 6 Bubble diagram of the top 20 KEGG pathways

图7 培元补肾安胎方潜在作用靶点富集在癌症信号通路图Fig 7 Potential effect targets of Peiyuan Bushen Antaiformula enriched in the cancer signaling pathway map

图8 培元补肾安胎方潜在作用靶点富集在P53 信号通路图Fig 8 Potential effect targets of Peiyuan Bushen Antaiformula enriched in the P53signaling pathway map

在分子对接前，将AR、caspase-3、CCND1、EG⁃FR、ESR1、FOS、MAPK8、MYC 的 蛋 白 结 构 从PDB 数 据 库 下 载，IL6 和VEGFA 的PDB 结 构 没 有原配体，故未分析。分子对接结果显示培元补肾安胎 方 的 核 心 化 合 物（MOL000098、MOL000422、MOL000354、MOL000006、MOL003896、MOL000392、MOL002714、MOL000417、MOL000173、MOL000497、MOL000211）和潜在作用靶点的对接得分均≤-5.0 kcal/mol，由此可以表明培元补肾安胎方与预测的作用靶点有较好的结合活性。具体分子对接分数见表2。配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生的作用可能性越大。由表3 可以得出结合性最强的是CCND1 蛋白与MOL000497 化合物。图9以三维模式表示了CCND1 的活性位点中MOL000497 的结合模式，图10 中以速写二维图展示了MOL000497 能与稳定的对接到CCND1 的1OR9 药效特征的活性口袋中。图11 和图12 显示Glu81，Leu83 的羰基与H 原子发生氢键作用，Leu83的N 原子与H 原子之间形成氢键作用，还有Gin85与6-ring 之间存在pi-H 键作用，但结合EHT 计算得出的键距以及键能值，Gin85 与6-ring 之间存在pi-H键作用影响不占主导因素，所以该药效团的主要特征是羰基与H 原子形成的氢键以及N 原子与H 原子形成的氢键上。EHT 计算量值表具体见表3。因此我们认为MOL000497 是培元补肾安胎方中重要的潜在活性化合物。

表2 8 个潜在靶点蛋白与前10 个化合物分子对接表Tab 2 The 8 potential target proteins and the first 10 compoundmolecular dockings

图9 MOL000497 与CCND1 的活性位点结合的三维图Fig 9 Three-dimensional diagram of binding of MOL000497 to the active site of CCND1

图10 MOL000497能与稳定的对接到CCND1的速写二维图Fig 10 Two-dimensional sketched diagram of MOL000497 stably connected to CCND1

图11 LEU 83 羰基与氢原子形成氢键Fig 11 The carbonyl group of LEU 83 forms a hydrogen bond with a hydrogen atom

图12 GLU81 与氢原子形成氢键Fig 12 GLU81 forms a hydrogen bond with a hydrogen atom

表3 配体与受体EHT 计算量值表Tab 3 Calculated value table of ligand and receptor EHT

3 讨论

中药复方具有成分多、靶点复杂、化合物之间成分协同作用于靶点等特征，这些因素造成目前中医药研究主要集中在单一的信号通路和作用靶点等，难以全面深入研究中医药作用机制。集系统生物学、药理学和生物信息学为一体的网络药理学，通过在网络模型中识别化合物-化合物、化合物-靶点、疾病-靶点等之间的相互作用，认识中药对生物网络的影响，构建化合物-蛋白-信号通路等网络，对作用靶点功能进行富集，系统的展示了中医药的作用机制。通过网络药理学的分析，探究培元补肾安胎方治疗复发性流产的作用机制，为其治疗复发性流产提供证据，有利于临床的进一步开发利用，也有利于进一步研究。

本研究筛选出培元补肾安胎方核心化合物有山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇、异鼠李素、木犀草素、刺芒柄花素、黄芩素、毛蕊异黄酮等，这些化合物大部分属于黄酮类化合物。黄酮类化合物具有非常重要的药用价值，其具有抗炎、抗氧化［25］、抗衰老［26］、抗肿瘤［27］、抑制肥胖和相关的代谢紊乱［28］等作用。桑寄生、菟丝子等中药材中都含有槲皮素，有研究发现槲皮素能抑制MCP-1 的生成，减少TNF-α，调节妊娠小鼠子宫内环境、改善小鼠胚泡着床障碍等从而发挥保胎作用［29，30］。黄芩素能提高滋养细胞的增殖和侵袭能力［31］。异鼠李素、木犀草素能有效的抑制TNF-α、IL-1β 等的释放，抑制炎症损伤，同时异鼠李素能通过激活PI3K/AKT 通路抑制氧化应激反应对细胞的损失［32，33］。木犀草素还参与细胞的上皮-间质转化，调节细胞的侵袭能力［34］。

通过构建作用靶点的PPI 网络发现VEGFA、IL6、EGFR、MAPK8、ESR1 等是培元补肾安胎方治疗复发性流产的核心蛋白。早期妊娠中滋养细胞入侵子宫蜕膜以及母体-胎盘血管生成、重塑非常重要，VEGFA 参与这一过程，子宫内膜中VEGFA 通过调节子宫内膜血管生成和通透性，促进子宫内膜蜕膜化，提高子宫内膜容受性［35］。表皮生长因子受体（EGFR）广泛分布于绒毛滋养细胞，有利于胎盘绒毛的生成，EGFR 促进细胞的增殖和血管生成［36］。有研究发现在早期妊娠丢失患者的子宫蜕膜 中VEGFA 和 绒 毛 组 织 中EGFR 表 达 下 降［37，38］。雌激素通过与雌激素受体结合在胚胎植入和妊娠维持起着重要作用［39］。雌激素受体分为雌激素受体α（ESR1）和雌激素受体β（ESR2），研究发现不明原因复发性流产患者的蜕膜组织雌激素受体降低［40］。有学者发现多囊卵巢综合征患者早期自然流产的子宫内膜ESR 减少，通过中西医结合治疗，能 明 显 改 善ESR 的 分 布［41，42］。由Th2 细 胞 分 泌 的IL6 主要参与体液免疫，抑制免疫反应，减少免疫过度损失。在早期妊娠中，IL6 调节激素的合成，促进滋养细胞的侵袭功能和胎盘血管形成，有利于成功妊娠［43］。调查发现复发性流产患者的IL6 水平低于正常妊娠人群。本研究通过对核心蛋白进行生物学功能分析显示主要参与调节转录因子活性、类固醇激素受体活性、类固醇结合、氧化活性、抗氧化活性、单加氧酶活性等生物学过程。临床观察发现寿胎丸能提高妊娠成功率，降低患者TNF-α、IL-6、IL-10 等炎症因子［44］，动物实验发现寿胎丸能改善大鼠的子宫内膜和卵巢黄体功能，提高孕酮水平，提 高RSA 孕 鼠 的 螺 旋 动 脉 的 生 理 性 重 铸［45，46］。与本研究结果相符合。

根据KEGG 富集通路结果提示，靶点受多种生物学途径的调控，培元补肾安胎方通过调节癌症信号通路、感染性疾病相关信号通路、TNF、细胞凋亡、P53、PI3K/AKT、MAPK 等信号通路来治疗复发性流产。P53 是人体重要的肿瘤抑制基因，参与诱导细胞周期阻滞、促进细胞凋亡和DNA 修复等，维持细胞基因组稳定及调节细胞分化与衰老功能［47］，P53 主要通过P53/P21、p53-tristetraprolinstathmin-1 等信号通路调节子宫内膜蜕膜化和滋养细胞功能，从而参与复发性流产的发生。研究发现p53 信号通路的多态性是复发性流产的高危因素［48］。细胞凋亡通路其主要包含线粒体凋亡和死亡受体凋亡途径两条重要途径。研究发现与散发流产患者相比，复发性流产患者绒毛组织的促凋亡蛋白明显增加，抗凋亡蛋白明显减少，从而引起细胞过度凋亡，不利于胚胎植入从而导致流产［49］。有学者发现寿胎丸含药血清通过上调BCL-2，下调BAX 蛋白减少自然流产患者滋养细胞凋亡［50］。丝裂原活化蛋白激酶信号通路（MAPK）参与细胞增殖、分化和凋亡等多种功能，目前研究发现MAPK信 号 通 路 主 要 包 含3 条：ERKs 通 路、JNKs 通 路 和p38 通路。MAPK 通路与子痫、流产等多种病理妊娠有关系。研究发现p38MAPK 信号通路调控滋养细胞的侵袭的关键酶，影响滋养细胞的侵袭功能［51］。越来越多研究发现复发性流产与母体免疫异常有关，p38MAPK 信号通路参与炎症反应，该通路的活化能激活大量的细胞因子如TNF-α、IFN-γ、IL-6 等合成和释放，介导炎症反应的发生与发展。黄酮类化合物能抑制MAPK 通路，从而减少炎症因子的分泌，减少炎性损失。本研究发现培元补肾安胎方的化合物主要为黄酮类，所以提示培元补肾安胎方可能通过调节MAPK 信号通路从而治疗复发性流产。PI3K/AKT 信号通路调节细胞的增殖、迁移和黏附能力，人类多种疾病的发生发展与该通路密切相关，如：卵巢早衰、高血压、肿瘤等。研究发现激活滋养细胞的PI3K/AKT 信号通路可以促进滋养细胞的增殖能力［52］。补肾中药能上调复发性流产患者蜕膜细胞PI3K/AKT 通路中的关键蛋白从而恢复蜕膜细胞的增殖功能，改善凋亡水平，从而改善妊娠结局。这些通路在复发性流产的发病机理和治疗过程中起着协同作用，也为中医药多靶点治疗提供了有力的依据。

分子对接学是计算机靶点预测工具，目前已被广泛用作基于配体的靶标预测和基于结构的靶标预测。目前这种虚拟筛选是鉴定特点配体，推定靶标的有前途的方法。利用MOE 软件对11 个活性成分及8 个靶点蛋白进行分子对接，提示筛选出的潜在靶点和结合性较高，验证了运用网络药理学方法对培元补肾安胎方治疗复发性流产的机制进行了初步探讨的可靠性。

本研究基于网络药理学对培元补肾安胎方的药效成分、作用靶点以及作用主要通路进行了分析，初步明确了培元补肾安胎方通过多成分-多靶点-多通路发挥治疗复发性流产，为后续深入研究相关作用机制奠定基础。但分析过程中未考虑方剂中的“君-臣-佐-使”关系，药物煎煮方式和时间，药物用法等因素，因此本结果尚需进一步动物实验和细胞实验加以验证。