长链非编码RNA DDX11-AS1对肝癌细胞增殖、侵袭能力的影响及其机制

羊丹，徐菁，陈保银，马竹芳

三二〇一医院，陕西汉中723000

肝细胞癌（HCC）是肝脏肿瘤最常见的类型［1-2］。现有的治疗方法对晚期HCC患者的疗效有限［3］。增殖和转移被认为是恶性肿瘤两个最重要的生物学特征，是肿瘤进展的重要原因［4］。研究HCC 进展相关机制将有助于进一步探索新的治疗靶点。长链非编码RNA（lncRNA）已被证明与HCC 的进展有关，随着高通量测序等技术的发展，越来越多新的lncRNA被发现［5］。DEAD/DEAH 盒解旋酶11 反义RNA1（DDX11-AS1）是与肿瘤密切相关的lncRNA之一，在胃癌、食管癌和骨肉瘤等多种肿瘤中高表达［6-8］。SHI 等［9］研究发现，DDX11-AS1 在HCC 中表达上调，与患者预后不良相关，可能是HCC 治疗的潜在靶点。但DDX11-AS1是否与HCC的增殖和侵袭相关，目前仍不明确。2018 年8 月—2020 年1 月，本研究观察了DDX11-AS1对HCC细胞增殖和侵袭的影响，并探讨可能机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要实验材料 人HCC 细胞HepG2、Huh-7、SK-hep-1 及正常肝细胞LO2 购自中国科学院。DMEM 高糖培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司。TRIzol 试剂购自日本TaKaRa 公司。ULtraRT一步法RT-PCR 试剂盒购自北京百奥莱博公司。DDX11-AS1 siRNA 购自广州锐博生物生物技术有限公司。MTS 试剂购自美国Biovision 公司。Tran⁃swell小室购自美国Coring公司。蛋白裂解液和蛋白浓度检测试剂盒购自上海碧云天生物有限公司。PI3K、pPI3K、AKT、pAKT 和GAPDH 抗体购自英国Abcam 公司。PI3K/AKT 信号通路激活剂SC79购自皓元生物技术有限公司。

1.2 不同HCC 细胞DDX11-AS1 检测 将HepG2、Huh-7、SK-hep-1 及LO2 细胞接种于含10% 胎牛血清的基础培养基中，于37 ℃、5% CO2全湿培养箱中培养。细胞长满时弃掉培养基，PBS 洗3 次，加入TRIzol 试剂，完全裂解细胞，并依次加入氯仿、异丙醇和无水乙醇离心后获取细胞中总RNA。按照RTPCR 试剂盒说明书将RNA 逆转录为cDNA，并继续进行扩增。PCR 反应体系包括2×ULtraRT one step Buffer 25 µL、ULtraRT one step EnzymeMix 1 µL、上下游引物各2 µL、RNA 1 µL，用无RNA 酶的双蒸水补足50 µL。反应条件：逆转录45 ℃30 min，PCR 预变性95 ℃5 s，变性94 ℃5 s，退火65 ℃30 s，延伸72 ℃30 s，变性、退火、延伸共40 个循环。以2-∆∆Ct计算DDX11-AS1 相对表达量。DDX11-AS1 上游引物序列为5"-TTAGGAGGACAACGAATCACCTC-3"，下游引物序列为5"-GTCATCTCCCAGAACCAGACTTT-3"。内参GAPDH 上游引物序列为5"-TGAAGGTCG⁃GAGTCAACGGATTT-3"，下游引物序列为5"-GCCATG⁃GAATTTGCCATGGGTGG-3"。

1.3 干扰DDX11-AS1 表达对HCC 细胞增殖、侵袭能力的影响观察

1.3.1 细胞分组及转染 取“1.2”中DDX11-AS1表达水平相对较高的HCC 细胞，以1.0×105/孔铺至6孔板中，培养至细胞贴壁。将HCC细胞分为对照组和实验组，分别转染NC siRNA和DDX11-AS1 siRNA，于培养箱中继续培养。转染48 h后，采用qRT-PCR法测得对照组、实验组细胞中DDX11-AS1 相对表达量分别为1.02 ± 0.04、0.35 ± 0.08，提示DDX11-AS1 siRNA可以抑制HCC细胞中DDX11-AS1的表达。

1.3.2 细胞增殖能力观察 细胞增殖率测算：收集两组细胞，以2×103/孔接种于96孔板中，每组设置5个复孔，放置培养箱中培养；48 h后每孔更换培养基100 µL，并加入MTS 试剂20 µL，在培养箱中孵育2 h，酶标仪检测各孔490 nm 处的光密度（OD）值；以实验组OD 值/对照组OD 值×100% 计算细胞增殖率。细胞克隆形成率测算：收集两组细胞，以2×103/孔接种于6 孔板中，每组设置3 个复孔，在培养箱中培养，每隔2 d 更换1 次新鲜培养基；待肉眼可见的细胞克隆团形成时终止细胞培养，PBS 洗3 次，甲醇溶液固定10 min，吉姆萨染色，干燥后计数细胞克隆团；以实验组克隆团数/对照组克隆团数×100% 计算细胞克隆形成率。

1.3.3 细胞侵袭能力观察 收集两组细胞，以无血清培养基洗3 次，制备为1×106/mL 的无血清细胞重悬液，每组设置3 个复孔。取细胞重悬液100 µL 加至Transwell 小室的上室膜上，含10% 胎牛血清的培养 基500 µL 加 至Transwell 小 室 的 下 室 中，并 将Transwell小室放入下室中。放置细胞培养箱中培养10 h 后终止培养，PBS 将未穿膜的细胞洗去，甲醇溶液固定10 min，吉姆萨染色，显微镜下计数穿膜细胞数表示细胞侵袭能力。

1.3.4 细胞中PI3K/AKT 信号通路蛋白检测 收集两组细胞，加入RIPA 蛋白裂解液，冰上震荡裂解30 min。4 ℃、14 000 r/min 离心30 min，去除细胞碎片，获得细胞总蛋白。检测蛋白浓度，加入上样缓冲液煮沸变性，80 V 电压下行蛋白电泳分离2 h，于350 mA将蛋白转至PVDF膜上，5% 脱脂牛奶常温孵育1 h。加入PI3K、pPI3K、AKT、pAKT 和GAPDH 一抗4 ℃孵育过夜，加入兔二抗室温孵育2 h。TBST洗3次后，采用ECL 超敏化学发光曝光条带，Image J软件分析蛋白灰度值。

1.4 SC79对DDX11-AS1作用的干预观察

1.4.1 HCC 细胞分组及处理 将HCC 细胞分为NC 组、si-DDX11-AS1 组 和SC79 组，NC 组转染NC siRNA，si-DDX11-AS1 组 和si-DDX11-AS1+SC79 组转染DDX11-AS1 siRNA。SC79组细胞加入5 µmol/L的SC79 10 µL，NC 组 和si-DDX11-AS1 组 加 入DMSO 10 µL，作用48 h后进行后续实验。

1.4.2 细胞增殖能力观察 收集三组细胞，采用MTS法检测各组细胞增殖能力。方法参照“1.3.2”。

1.4.3 细胞侵袭能力观察 收集三组细胞，采用Transwell 实验检测细胞侵袭能力。 方法参照“1.3.3”。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件。计量资料以表示，两组比较采用t检验，多组比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC 细胞中DDX11-AS1 表达变化 HepG2、Huh-7、SK-hep-1、LO2 细胞中DDX11-AS1 相对表达量分别为7.28 ± 0.78、3.55 ± 0.54、5.08 ± 0.12、1.00 ± 0.02，HepG2、Huh-7、SK-hep-1 细 胞 中DDX11-AS1 表达高 于LO2 细 胞，其中HepG2 细胞DDX11-AS1表达量最高（P均＜0.05）。

2.2 干扰DDX11-AS1 表达对HCC 细胞增殖、侵袭能力的影响 实验组细胞增殖率、克隆形成率、穿膜细胞数及细胞中pPI3K、pAKT 蛋白表达均低于对照组（P均＜0.05）。见表1、表2。

2.3 SC79 激 活PI3K/AKT 通路 对si-DDX11-AS1 组HCC 细胞增殖、转移能力的影响 SC79 组、si-DDX11-AS1 组细胞增殖率和穿膜细胞数低于NC组，SC79 组细胞增殖率和穿膜细胞数高于si-DDX11-AS1组（P均＜0.05）。见表3。

表1 实验组与对照组细胞增殖、侵袭能力指标比较（）

表1 实验组与对照组细胞增殖、侵袭能力指标比较（）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

组别实验组对照组穿膜细胞数（个）47.33 ± 7.02*102.67 ± 11.02细胞增殖率（%）67.33 ± 5.99*100.00 ± 2.00克隆形成率（%）33.87 ± 3.01*100.00 ± 1.00

表2 实验组与对照组细胞中PI3K/AKT信号通路蛋白表达比较（）

表2 实验组与对照组细胞中PI3K/AKT信号通路蛋白表达比较（）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

组别实验组对照组pAKT 0.06 ± 0.04*0.50 ± 0.10 PI3K 0.81 ± 0.17 0.86 ± 0.09 pPI3K 0.11 ± 0.07*0.41 ± 0.11 AKT 0.56 ± 0.13 0.53 ± 0.09

表3 SC79组、si-DDX11-AS1组、NC组细胞增殖、侵袭能力指标比较（）

表3 SC79组、si-DDX11-AS1组、NC组细胞增殖、侵袭能力指标比较（）

注：与NC组相比，*P＜0.05；与si-DDX11-AS1组相比，#P＜0.05。

组别SC79组si-DDX11-AS1组NC组穿膜细胞数（个）72.67 ± 7.51*#39.33 ± 15.01*112.33 ± 19.08细胞增殖率（%）76.20 ± 5.92*#60.21 ± 8.06*100.00 ± 5.00

3 讨论

HCC 是病死率很高的消化系统恶性肿瘤，发病率呈逐年上升趋势［1］。肝切除、肝移植、局部消融治疗和经动脉化学栓塞等疗法广泛用于HCC 的治疗［10］，但HCC 的恶性程度较高，常复发和转移，导致HCC 患者的预后较差［3］。HCC 的发病机制很复杂，涉及多种因素，包括乙型或丙型肝炎病毒感染、黄曲霉毒素等暴露、饮酒过量、遗传和表观遗传学等改变［11-12］，确切的发病机制仍不明确。深入研究HCC发生发展的分子机制，对于开发有效治疗干预措施、改善HCC患者预后至关重要。

lncRNA 是一种长度超过200 个核苷酸的RNA，由于其缺少完整的开放阅读框，不具有编码蛋白质的功能［13］。lncRNA 参与人体多个生理过程的调节，其表达失调与肿瘤的发生和发展有关，这使得ln⁃cRNA 有望成为恶性肿瘤诊断和治疗的靶点［14］。DDX11-AS1 是DDX11 的反义RNA，DDX11 是一种DNA 依赖性的ATPase 和解旋酶，参与DNA 复制和姐妹染色单体的内聚，而DDX11-AS1 可以调节DDX11 的活性，因此DDX11-AS1 是DNA 复制和细胞周期进程所必需的［15］。研究发现，DDX11-AS1 的异常表达可导致肿瘤的恶性进展。SHI 等［9］采用生物学信息分析技术发现HCC 组织中DDX11-AS1 高表达，并预示较差的预后，与HCC 恶性进展相关。本研究首先检测了DDX11-AS1 在HCC 细胞中的表达 情 况，发 现HepG2、Huh-7、SK-hep-1 细 胞 中DDX11-AS1 表达均高于正常肝细胞，与大数据分析的结果一致［9］。选择DDX11-AS1 表达相对较高的HepG2 细胞转染DDX11-AS1 siRNA，检测结果发现，抑制DDX11-AS1 表达后，HCC 细胞的增殖能力和转移能力均降低，与膀胱癌和结直肠癌等肿瘤中DDX11-AS1 表达的相关研究结果一致［16-17］。这表明DDX11-AS1表达上调可促进HCC的恶性进展。

现已证实DDX11-AS1 可以被癌基因MYC 激活，同时被抑癌基因p53负调控，参与肿瘤的发生发展［14］。FENG 等［18］报道，DDX11-AS1通过激活PI3K/AKT 信号通路促进非小细胞肺癌的进展。PI3K/AKT 信号通路对细胞分化、增殖、凋亡等均具有重要的调控作用，且PI3K/AKT 信号通路与HCC 发病关系密切。PI3K 是一种细胞内磷脂酰肌醇激酶，其磷酸化水平的提高与肿瘤的发生发展有关。而其下游信号分子AKT 在HCC 中处于激活状态［19］。抑制PI3K/AKT 信号通路激活，肿瘤的增殖和转移受到抑制，因此PI3K/AKT 信号通路被认为是抗肿瘤治疗的有效靶点。本研究发现，抑制DDX11-AS1 表达后，HCC 细胞中pPI3K 和pAKT 蛋白表达降低，表示PI3K/AKT 信号通路的激活受到抑制。 SC79 是PI3K/AKT 信号通路激活剂，可以增加PI3K 磷酸化水平。为了进一步研究DDX11-AS1是否通过PI3K/AKT 信号通路促进HCC 细胞的增殖和侵袭能力，我们以SC79 处理DDX11-AS1 表达受到抑制的HCC 细胞，观察结果显示，SC79 可以使因DDX11-AS1 表达降低而导致增殖、侵袭能力受抑制的HCC 细胞的恶性生物学行为得到部分恢复，提示DDX11-AS1 可能通过激活PI3K/AKT 信号通路促进HCC 的恶性进展。

综上所述，HCC 细胞中DDX11-AS1 表达上调；干扰DDX11-AS1 表达可抑制HCC 细胞的增殖和侵袭能力，其机制可能与调控PI3K/AKT 信号通路有关。DDX11-AS1有望成为抗HCC治疗的新靶点。