甲硝唑药物锰配合物的合成及与DNA的相互作用

杨莉宁,黑嘉慧,成 昭,苗延青

(1.西安医学院 药学院，陕西 西安 710021；2.陕西航天职工大学，陕西 西安 710100)

甲硝唑 (Metronidazole，MTZ)具有广谱抗厌氧菌和抗原虫的作用，临床主要用于预防和治疗厌氧菌引起的感染，是硝基咪唑类的代表性药物[1-2]。其抗厌氧菌的作用机理为，在厌氧细胞内甲硝唑被还原为中间活性物，该中间物与细菌内的DNA作用，使DNA螺旋结构断裂，破坏微生物正常的新陈代谢而致细胞死亡[3-4]。近年来报道甲硝唑在临床上存在着耐药性和不良反应，对甲硝唑进行修饰，增强其抗菌作用，减少不良反应，是药物化学领域一个热门课题。

许多金属离子与药物结合，能增强药物的抗菌能力，有报道甲硝唑金属配合物通过甲硝唑与金属离子的协同作用表现较强的抗菌活性[5]。而金属锰在生物学中作为酶的激活剂和必需辅助因子具有许多重要作用，尤其对骨骼发育、细胞结构、能量代谢、线粒体氧化还原和细胞凋亡至关重要[6]。多项体外研究表明Mn 与DNA、RNA 和核糖体结合导致蛋白转录和翻译失调[7]。近年来，Mn(II) 作为一种能够有效调节细胞代谢的新型金属元素引起了广泛关注[8]。

Scheme 1

研究表明甲硝唑的一些过渡金属配合物较甲硝唑具有良好的体外抗革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的性能[9]，而关于甲硝唑锰配合物和DNA相互作用的研究未见报道。以甲硝唑与醋酸锰(Ⅱ)为原料，合成甲硝唑的锰 (Ⅱ)配合物，并通过元素分析、IR、UV-Vis、电导率、热失重等方法对其进行了结构表征，研究了配合物与小牛胸腺DNA(ct-DNA)的相互作用方式，希望为进一步探讨甲硝唑金属药物的抗菌机理提供参考信息。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Vario EL-IIIG型元素分析仪；EQUINOX55 型红外光谱仪；800型紫外可见分光光度计；Ubbeoldhe型粘度计；DDS-307型电导率仪。

甲硝唑 (原料药,陕西省药检所)，小牛胸腺DNA(生化试剂，Sigma公司)；其余所用试剂均为分析纯。

1.2 配合物的合成

分别称取甲硝唑0.342g(2 mmol)溶解于15 mL甲醇中，醋酸锰[Mn(AcO)2·4H2O)] 0.245g(1 mmol)溶解于10 mL甲醇中，将甲硝唑溶液缓慢加入到醋酸锰溶液中，在室温下搅拌反应72 h，过滤静置，室温下挥发溶剂。20 d后有红棕色黏稠物生成，加入无水乙醚形成土色沉淀，过滤，滤饼用无水乙醚洗涤、干燥得淡棕色粉末状固体，产率75%(以Mn计)。

1.3 配体及其配合物与DNA相互作用

与DNA相互作用实验所需试剂的配制及相关实验操作按照文献[10-11]方法进行。

2 结果与讨论

2.1 配合物的结构表征

(1) 元素分析和摩尔电导率

表1的数据表明配合物元素分析的实验值与理论值较为一致，基本可以确定其化学组成。根据摩尔电导率值可以判断配合物在甲醇中属于非电解质[12]。

表1 配合物的元素分析及摩尔电导率Table 1 Element analysis and molar conductivity data of complex

(2) IR

当甲硝唑配体形成金属配合物以后,有些特征吸收峰发生了一定程度的偏移，其中咪唑环上的ν(C=N)伸缩振动由1536 cm-1向高波数1541 cm-1发生了偏移,说明金属与咪唑环上的3-N发生了配位[13]，而位于指纹区的445 cm-1吸收峰可以指派为配位键ν(Mn—N)。硝基的伸缩振动ν(NO2)吸收峰变化不大，说明硝基未参与配位[14]。与配体相比，配合物中含有CH3COO-，其νas(COO-) 和νs(COO-)分别为1566 cm-1，1360 cm-1，Δνas(COO-)-νs(COO-)值为206 cm-1，这与文献报道[15]的醋酸根对称桥连配位模式的红外吸收峰情况基本一致，说明醋酸根可能与两个Mn原子桥连配位[16]。同时配合物在3400 cm-1处有一宽峰，表明有水参与配位[17]。

(3) UV-Vis

由图1可见，配体在200～400 nm范围内有两个主要吸收峰分别位于240 nm和320 nm处，可分别归属为有机配体咪唑环共轭体系的π→π*和n→π*电子跃迁。和配体相比，配合物在240 nm处的吸收发生了紫移，出现在230 nm处，并且紫外吸收强度明显增强，这是金属Mn(Ⅱ)离子与配体发生配位的结果。

λ/nm图1 配体L和配合物的UV-Vis谱图Figure 1 The UV-Vis spectru of Ligand and complex

(4) TGA

由图2可见配合物[Mn2(C6H9O3N3)2(Ac)4(H2O)2]·6H2O热分解过程大致有4步。首先在68～188 ℃表现两个吸热过程，TG曲线坍塌失重12.89%，该失重的两个吸热过程是配合物逐步失去6个结晶水分子(失重理论值为12.98%)所致。第二步的热分解温度区间为189～240 ℃，DSC表现出有一个放热峰和一个吸热峰，TG曲线显示失重18.87%，该过程是配合物受热失去两个配位水分子和两个醋酸根离子所致(失重理论值为18.52%)。第三步的热分解温度区间为190～325 ℃，DSC曲线显示吸热过程的峰顶温度为305 ℃，失重率为20.20%，对应于失去一个甲硝唑分子(失重理论值为20.56%)。第四步配合物失去最后一个甲硝唑配体分子(失重率理论值20.56%)，热分解温度区间位于326～830 ℃，在813 ℃有一弱的放热过程，失重率21.52%，随着连续加热配合物不断失重，当加热至1000 ℃时残余物为黑色，含量20.66%，与生成MnO2的理论残余量20.91%相近。

Temperature/℃图 2 配合物的TGA曲线图Figure 2 TGA curves of complex

2.2 配合物结构

根据以上实验数据，结合文献[16]，配合物[Mn2(C6H9O3N3)2(Ac)4(H2O)2]·6H2O的结构如Chart 1所示。

Chart 1

2.3 配合物与ct-DNA的相互作用

(1) 甲硝唑及其配合物与DNA相互作用的UV-Vis

由图3可见，在320 nm左右甲硝唑配体及配合物均有紫外最大特征吸收峰，为甲硝唑分子内π→π*的电子跃迁吸收。配体及配合物的紫外特征吸收峰随着DNA的不断加入都表现出显著的减色效应(0.95→0.91，2.15→2.07)，表明配合物与DNA发生了键合作用[18-19]。

(2) 甲硝唑及其配合物与 ct-DNA 相互作用的荧光光谱

图4表明甲硝唑配体及其配合物的荧光强度随着DNA浓度的增大均表现出显著的增色效应，甲硝唑的荧光强度增幅大于配合物。化合物荧光强度增加，究其原因可能是甲硝唑及其配合物插入或部分插入DNA分子所致。因为当化合物插入刚性比较强的DNA分子时，DNA能够很好地保护化合物发光，这与己知的一些插入试剂在DNA存在时荧光强度增强的现象一致[20-22]。

λ/nm

(3) 甲硝唑及其配合物与 ct-DNA 相互作用的黏度

具有光学活性的光物理探针对于探讨键合模式一般可以提供必要的但不是充分的证据[23]。没有晶体数据时，一般认为确定键合模式最有力的证据之一是物质黏度的变化，分子长度的变化对物质黏度的影响非常大[24]。若化合物以经典插入方式与DNA相互作用，DNA相邻碱基对的距离会变大，DNA螺旋拉长，导致DNA黏度增加。若DNA溶液的黏度几乎不变，则化合物与DNA相互作用是以非插入方式(静电、沟槽结合等)进行的。DNA的黏度如果减小，则化合物以部分插入方式与DNA作用，这时DNA的双螺旋可能发生扭结或弯曲导致黏度减小[25-27]。因而，需用黏度法对光谱法得到的结果进行验证，以便较为准确的判断化合物与DNA的键合模式。

λ/nm

由图5可以看出，DNA溶液的黏度随各物质浓度的增加而增大，配体L对DNA溶液黏度的影响更大。黏度分析的结果表明配体及配合物均以插入方式与DNA相互作用，由于甲硝唑配体分子的平面性强于配合物，配体与DNA的相互作用力较大，这与光谱实验的结果一致。

Ccompound/CNDA图 5 配体L及其配合物浓度对DNA粘度的影响Figure 5 Effects of increasing amount of L and complex on the viscosity of DNA

合成了甲硝唑的Mn(Ⅱ) 配合物[Mn2(C6H9O3N3)2(Ac)4(H2O)2]·6H2O，利用元素分析、紫外光谱、红外光谱、摩尔电导率、热重分析等分析方法确定了产物可能是一个醋酸根桥连的二核金属配合物。并通过紫外吸收光谱、荧光光谱及黏度法研究了甲硝唑配体及其锰配合物与 ct-DNA的相互作用，综合分析光谱法和黏度法的实验结果可以认为配体及其锰配合物与 ct-DNA之间可能以经典的插入式相互作用，由于甲硝唑配体分子结构的平面性较配合物更好，配体与ct-DNA的相互作用强于配合物。