手性仿酶催化剂用于纯水相制备埃索美拉唑

张瑶瑶,彭文举,黄 杰,杨世龙,罗 杰,丁 伟,丁 瑜,朱 磊

(1.湖北工程学院 化学与材料科学学院，湖北 孝感 432000；2.孝感市中心医院，湖北 孝感 432000)

胃溃疡是一种临床上发病率和复发率均较高的慢性消化系统疾病，可引发胃穿孔、胃出血、癌变等并发症。质子泵抑制剂是目前治疗消化性胃溃疡最先进的一类药物[1]，主要原理是通过抑制壁细胞膜的H-K交换进而抑制壁细胞分泌胃酸的功能，并清除幽门螺旋杆菌[2-4]。目前国内市面上的质子泵抑制剂主要包括埃索美拉唑、泮托拉唑、兰索拉唑、雷贝拉唑盐等[5-11]。其中，埃索美拉唑应用最为广泛，具有起效快、作用强、更持久等优点[12]。埃索美拉唑镁或埃索美拉唑钠作为左旋异构体盐，具有药物代谢受基因多态影响弱、个体差异小、抑制酸分泌强、无药物耐受等优异特性[13]，因此该类物质市场需求大。

目前制备埃索美拉唑的方法主要分为拆分法和不对称氧化法[14-20]。拆分法成本高、收率低，限制了其工业生产效益。另一种方法为不对称催化氧化法，其关键在于制备出成本低、性能优异的催化剂，经过不对称催化奥美拉唑硫醚底物获得手性单一S-奥美拉唑[21-23]，并采用各种表征手段确定产物构型及纯度[24-29]。Mahale等[30]使用10-樟脑氧氮杂环丙烷作为手性氧化试剂选择性氧化硫醚，但终产物对映体选择性并不高。Codexis实验室[31]成功设计了B-V加氧酶，催化前手性奥美拉唑硫醚氧化成S-奥美拉唑亚砜，在氧气条件下得到高对映体选择性手性产物。

Scheme 1

工业生产埃索美拉唑均是在有机相中进行，易造成环境污染。但水相中催化反应存在传质困难、催化效率低、催化剂难回收等问题，N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)具有温度响应性，可在室温下溶于水，升温从水相中析出，应用于催化剂载体便可实现催化剂的温控分离及便捷回收，实现催化剂水相高效催化和有效重复使用[32-34]，从而解决环境污染问题。以PNIPAAm为载体构建的酶催化可用于生物体内水相环境中各类化学反应，位点分离、疏水间隔是酶催化体系的重要特征。响应型聚合物通过在溶液中围绕催化活性位点自组装，可形成一种仿酶空腔的纳米结构，进而模拟生物酶的高效催化性能。

将温敏材料和手性氨基酸进行可控聚合制备出单链嵌段聚合物，利用金属钛盐与氨基酸的配位作用，结合分子内疏水作用促使单链嵌段聚合物发生自单链折叠形成纳米反应器。采用现代表征手段对催化剂在水溶液中的形貌进行表征，将催化剂用于纯水相中研究不对称催化氧化奥美拉唑性能。反应结束后，通过升温实现催化剂的便捷回收，考察催化剂回收及重复使用性能，模拟出工业制备埃索美拉唑最优催化路线。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

WZZ—2S/2SS型数字式自动旋光仪；Agilent 8453型紫外光谱仪；Bruker Drx 400 HMz型核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标)；Vertex 70型红外光谱仪；Alltech型凝胶色谱仪；Agilent 1100型高效液相色谱仪。

所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1) 温敏型仿酶催化剂的制备

依次称取L-苯丙氨酸10 mmol,三乙胺11 mmol，溶解于20 mL无水二氯甲烷中，0 ℃下缓慢滴加30 mL溶有丙烯酰氯(11 mmol)的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，缓慢升高温度至室温，继续反应2～8 h。反应结束后，向反应液中添加10 mL饱和NH4Cl溶液，CH2Cl2(2×5 mL)萃取水层，有机层用30 mL饱和NaHCO3洗涤，Na2SO4干燥，浓缩得淡黄色油状液体。硅胶柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯/正己烷=1/1,V/V)纯化得目标产物，产率72%；IRν:3283,3063,3030,2959,1732,1659,1632,1543,1406,1316,1296,1268,1191,1126,1066,1031,986,965,915,748,700,668,605,576,516,489 cm-1。

RAFT制备温敏型手性氨基酸嵌段聚合物：分别取NIPAAm(50 mmol)和上述已制备的含有碳碳双键的手性氨基酸化合物(10 mmol)溶于无水甲醇中，将溶液转移到Schlenk管中，硫代丙酸卞酯0.0330 g(0.2 mmol)和AIBN 0.0052 g(0.03 mmol)加入到反应液中。N2保护下，将反应液置于60 ℃反应24 h，反应结束后，真空浓缩反应液，多倍过量乙醚做沉淀剂处理反应液，得到淡黄色固体产物，30 ℃真空干燥，得手性氨基酸嵌段聚合物PN50A10。

表1 5种不同亲疏水比例催化剂表征Table 1 Characterization of five catalysts with different hydrophilic and hydrophobic ratios

Scheme 2

取4 mmol上述制备的PN50A10溶于无水二氯甲烷中，待溶解充分后加入2 mmol四异丙基钛酸酯，室温反应8 h。旋干溶剂，加入2 mL四氢呋喃溶解产物，2滴水振荡，减压抽滤后旋干溶剂，适量乙醚反复沉淀得到黄色固体沉淀，30 ℃下，真空干燥得到催化剂TiIV-PNxAy，产率86%；IR:3423,3062,2965,1728,1614,1556,1454,1395,1135,1105,1044,924,836,675,617,558,511 cm-1。

(2) 5-甲氧基-2-[(4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲硫基]-1H-苯并咪唑的合成

取10 mmol 2-氯甲基-3,5-二甲基-4甲氧基吡啶盐酸盐和10.5 mmol 5-甲氧基-2-巯基苯并咪唑溶于40 mL甲苯中，溶液转移至100 mL反应釜中，加入0.4 mmol四甲基溴化铵(TBAB)，缓慢滴加2 mL质量分数为20 %的氢氧化钠溶液，将反应釜置于60oC反应4 h。反应结束后，冷却到室温，调节pH至7～8之间，静置分层。采用甲苯(3×10 mL)萃取水层，合并有机相，热水洗涤，减压浓缩，降温结晶，减压抽滤，60 ℃真空干燥。得到白色固体，收率86%；1H NMR(CDCl3,500 MHz)δ:2.23～2.31(s,6H),3.78(s,3H),3.83(s,3H),4.35(s,2H),6.80～6.81(dd,2H),7.03(s,1H),7.40(s,1H) ,8.26(s,1H)；13C NMR(CDCl3,125 MHz)δ:165.1,156.0,148.4,126.4,125.5,111.0,60.1,55.8,35.1,13.4,11.3。

(3) 埃索美拉唑的合成

向10 mL反应瓶中加入适量催化剂TiIV-PNxAy，取1 mL溶剂将催化剂溶解后，加入1 mmol的底物5-甲氧基-2-[[(4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基]硫基]-1H-苯并咪唑硫醚。反应瓶置于25℃条件下恒温，缓慢滴加1.2 mmol 30 %H2O2(TCL检测)。剩余溶剂用CH2Cl2(3×10 mL)萃取，浓缩得到红色油状液体，加入少量丙酮析出固体、过滤、甲醇洗涤，得到白色固体，硅胶柱层析(洗脱剂：甲醇/二氯甲烷=2/8,V/V)纯化得埃索美拉唑，收率95%;1H NMR(CDCl3,500 MHz)δ:2.06～2.16(s,6H),3.54(s,3H),3.78(s,3H),4.73～4.76(AB-system,2H),6.87～6.90(dd,2H),7.48(d,1H),8.14(s,1H)；13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:164.2,157.2,151.5,149.5,148.6,126.8,126.2,113.9,60.5,59.7,55.6,13.2,11.3。

(4) 埃索美拉唑钠的合成

2 结果与讨论

2.1 表征

(1) FT-IR

采用FT-IR表征了聚N-异丙基丙烯酰胺PNIPAAm(a)；新鲜温敏型氨基酸钛催化剂TiIV-PN50A10(b)，回收催化剂TiIV-PN50A10(b′)，结果如图1所示。

由图1可得，温敏聚合物PNIPAAm在3309 cm-1和3072 cm-1表现出—CONH—中—NH—的特征峰，在2973，2930 cm-1表现出—CH—CH—中—CH—的特征峰，在2876 cm-1表现出—CH(CH3)2中—CH3的特征峰，1653 cm-1和1540 cm-1表现出—CH(CH3)2中—CH—的伸缩振动峰，与之前所报道一致[32](图a)。上述这些特征峰在催化剂TiIV-PN50A10中依然存在，证明催化剂结构中含有温敏单元聚合物。此外，催化剂TiIV-PN50A10在704 cm-1出现金属Ti—O—Ti配位的特征峰，证明金属钛成功配位到氨基酸单元的氮原子上(图1b)，催化剂结构符合设计。在此基础上，对回收后的催化剂同样进行红外表征，结果表明，回收后的催化剂与新鲜催化剂结构吻合，催化剂在反应前后，结构并未被破坏(图1b′)。

ν/cm-1图1 聚合物PNIPAAm(a)，新鲜催化剂TiIV-PN50A10(b)和回收催化剂TiIV-PN50A10(b′)FT-IR谱图Figure 1 FT-IR spectra of PNIPAAm(a),fresh TiIV-PN50A10(b),TiIV-PN50A10 reused for six times(b′)

2.2 催化剂性能

(1) 5种催化剂性能比较

为了筛选出性能优越的催化剂，将5种不同亲疏水比例催化剂用于水相催化奥美拉唑的不对称氧化反应，其结果如下表2所示，各催化剂反应动力学如图2所示。

由表2可得，不同亲疏水比例中，催化剂TiIV-PN50A10的催化效果最好，所得到的收率和对映体选择性均最高(收率达到95%，对映体选择性高达98%)，几乎可实现硫醚定量转化成对应手性亚砜产物。当减少亲水端比例时，所形成的纳米反应器外层亲水基团减少，不能很好的将疏水底物硫醚包裹进疏水纳米反应空腔内部，因此导致催化剂TiIV-PN30A10和TiIV-PN40A10的催化效果均有所下降。增加亲水端比例时，催化剂TiIV-PN60A10和TiIV-PN70A10中疏水活性中心减少，催化活性减弱，反应相同时间，产率和对映选择性均下降。综上，选择催化剂TiIV-PN50A10进行催化反应性能考察。

表2 不同亲疏水比例催化剂应用于纯水相不对称奥美拉唑氧化反应Table 2 The asymmetric omeprazole oxidation catalyzed by different catalysts in water

如图2所示，温敏型催化剂在反应开始时，均表现出较低的催化效率。直至90 min后，反应速率迅速增大，随后反应速率呈线性增长。这一趋势表明，催化剂在水中形成纳米反应器，反应初期，硫醚底物缓慢进入纳米反应器内部，当底物浓度达到一定后，疏水空腔内部的底物与活性中心急剧碰撞，从而加快反应速率，表现出酶催化的特性。因此，该法制备的催化剂表现出极高的催化效率，可大大提高工艺生产效率，并解决环境污染问题。

Time/min图 2 各催化剂反应动力学Figure 2 Kinetic curves of asymmetric omeprazole oxidation catalyzed by different catalysts in water

(2) 溶剂效应

为了观察催化剂在水中反应的实时动态，采用动力学研究反应过程。反应溶剂对于催化反应过程中纳米反应器的构筑至关重要，因此，研究了不同溶剂中催化剂的催化性能，结果如表3所示。

表3 不同溶剂的影响Table 3 The effect of different solvents

由表3可见，溶剂为水时，催化剂TiIV-PN50A10效果最好。在水溶液中，催化剂溶解性良好，在水中分子内疏水作用力下可自折叠形成纳米反应器，疏水活性中心包裹在纳米反应器内部。加入有机反应底物奥美拉唑硫醚后，在疏水驱动力下，底物进入纳米反应器内部被大量富集。水相氧化剂双氧水缓慢进入纳米反应器内部，与足量硫醚剧烈碰撞，从而加速反应进行，纳米反应器可有效阻止氧化剂过量形成砜。因此，催化剂TiIV-PN50A10在水中相比有机溶剂可获得更高的产率和对映体选择性，表现出仿生催化特性。催化剂在有机溶剂中不能通过自组装形成纳米反应器，因此，有机相催化反应效率低、对映体选择性差。

(3) 其它底物

将性能最优催化剂用于不同底物的考察，结果如表4所示。由表4可得，催化剂TiIV-PN50A10应用于不同底物均具有良好的催化效果，在纯水相反应体系中，室温条件下，反应3 h均能得到较高的产率和对映体选择性。兰索拉唑反应3 h实现92%的收率和97%的对映体选择性，因此该类催化剂在水溶液中可自组装形成纳米反应器，疏水底物进入纳米反应器空腔，实现高效催化，解决了催化剂水相催化传质差、效率低等问题，表现出仿生催化的特性。同时，奥美拉唑亚砜、兰索拉唑亚砜、泮托拉唑亚砜和雷贝拉唑亚砜均属手性药物，该法可制备出高收率、高对映体选择性手性产物，在工业中具有很好的应用前景。

表4 不同底物应用于纯水相不对称催化氧化反应Table 4 Results of asymmetric oxidation over different substrates

(4) 催化剂循环性

将经过升温、洗涤、干燥后回收的催化剂重新置于水溶液中溶解后，加入反应物开始重复实验，实时监控反应，待反应结束后分离催化剂和产物，计算产率和对映体选择性等。

催化剂TiIV-PN50A10重复使用5次，产物埃索美拉唑的产率基本保持不变，对映体选择性可维持在94%以上。将催化剂配制成浓度为0.5 mg/mL的水溶液，测量其升温和降温过程中紫外透光率的变化，结果表明，催化剂具有良好的温度响应性，经过反复升温降温，其紫外响应信号依然灵敏。该项研究表明，通过RAFT法制备得到的温敏型手性氨基酸钛催化剂可实现重复使用。

(1) 以自然界中来源广泛的手性氨基酸和工业化温敏材料N-异丙基丙烯酰胺为原料，采用RAFT法，制备出系列温敏型聚合物PNxAy，并利用金属配位作用得到温敏型氨基酸钛催化剂TiIV-PNxAy，制备方法简单，工业可操作性强。

(2) 将催化剂用于纯水相不对称硫醚氧化反应中，仅1.0 mol%催化剂反应3 h，即实现埃索美拉唑收率达95%，对映体选择性高达98%。可定量获得手性单一的埃索美拉唑药物，表现出仿生催化特性，详细探究了催化剂亲疏水比例、动力学、溶剂等影响因素，得到最优催化反应体系。

(3) 催化剂室温下可很好的溶于水，升温即可从水相中的析出，实现催化剂的温控便捷回收和重复使用，实验室可重复使用5次以上。