姜黄素对前列腺癌细胞自噬的影响

刘 智，任 鹏，刘凤炼，龙 金，陈志涛，石 磊，杨 喆，高晓勤

(1.贵州医科大学第二附属医院，贵州 凯里 556000；2.贵州医科大学，贵州 贵阳 550004)

前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤，严重威胁男性身心健康。近年来前列腺癌的发病率和死亡率逐年升高[1-2]。迄今为止，关于前列腺癌的发病机制尚不完全清楚。大量文献证实，前列腺癌发生常与DNA甲基化、雄激素受体基因异化、生长因子与表皮机制相互作用以及自噬等有关[3-5]。其中自噬被认为是与肿瘤发生发展的重要机制之一[6]。新近研究证实，Akt/mTOR信号通路作为调控自噬的经典通路参与前列腺癌的发生发展过程[7]。

姜黄素是一类从姜科草本植物郁金的根所提取得到的酚类物质，具有广泛的药理活性，包括抗肿瘤、抗炎、清除自由基、抗氧化等作用[8-9]。本研究旨在探讨姜黄素诱导前列腺癌LNCaP细胞自噬的作用机制，为前列腺癌的治疗提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 LNCaP细胞购自中科院细胞库；姜黄素(纯度98%，购自Sigama公司)；Akt、pAkt、mTOR、pmTOR抗体、LC3抗体、p62 抗体(购自Sigama公司)；MTT Assay试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(购自碧云天生物科技有限公司)。流式细胞仪(购自BD公司)；酶标仪(购自Bio-Teck)；PCR仪(购自美国Thermo公司)；垂直电泳仪(北京百晶生物)；培养瓶、培养板等(corning)；CO2细胞培养箱(NUAURE)。

1.2 细胞培养与处理 用含10%热灭活的胎牛血清以及抗生素的DMEM培养基培养(37℃、5%CO2)，进入对数生长期后实验。实验分为对照组、姜黄素处理组(浓度为10、20、40 μmol/L)。作用24 h后实验。

1.3 MTT检测细胞增殖 MTT法分析细胞活性，将LNCaP细胞接种于培养板中的培养24 h后，不同浓度姜黄素处理24 h，弃上清，加入100 μl MTT溶液37℃继续孵育2 h，再加入100 μl DMSO溶液，震荡。并于570 nm波长处测定其吸光度，并计算细胞相对活性，计算公式：处理组吸光度/对照组吸光度×100%。

1.4 流式细胞术 采用流式细胞术对细胞自噬进行量化分析。细胞接种于培养板24 h后，经不同浓度姜黄素处理24 h后。收集细胞，PBS洗涤两次，用吖啶橙在4℃下染色15 min。用流式细胞仪FL1和FL3通道检测细胞荧光强度。上述实验重复三次。自噬率(%)=(FL3/FL1)×100。

1.5 RT-PCR实验 LNCaP细胞培养经姜黄素(0、10、20、40 μmol/L)处理24 h后。用 Trizol试剂盒提取总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增。每个样本总体积25 μl(包括染料12.5 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、ddH2O28 μl、cDNA 2.5 μl)反应条件为：90°C预变性l0 min，95°C变性10 s，60°C退火20 s，72℃延伸34 s，40个循环，β-actin为内参，检测各模板的Ct值。以 2-ΔΔCt反映Beclin-1基因相对表达量。(Beclin-1上游引物：5’-AAA CCA GAT GCG TTA TGC CC-3’，下游引物：5’-GCG ACC CAG CCT GAA GTT AT-3’；β-actin上游引物：5’-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3’，下游引物：5’-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3’)

1.6 Westernblot分析 收集约1×106个LNCaP细胞，加入裂解缓冲液冰上裂解30 min，然后蛋白定量。获取50 μg蛋白在分离胶中进行电泳，结束后将其转膜上，并用牛血清白蛋白封闭2 h。加入相应一抗以及二抗，进行化学发光、显影。

2 结果

2.1 姜黄素对LNCaP细胞增殖的影响 为了评价不同浓度姜黄素对LNCaP细胞增殖的影响，本研究首先采用姜黄素(0、10、20、40 mol/L)孵育LNCaP细胞24 h，之后采用MTT法检测细胞活力。结果显示，随着姜黄素剂量增加，对LNCaP细胞生长的抑制作用越显著，并呈剂量依赖(见图1)。流式细胞术检测LNCaP细胞自噬情况，结果显示，姜黄素呈剂量依赖地诱导LNCaP细胞的自噬反应(见图2)，这提示姜黄素诱导LNCaP细胞的自噬。

图1 姜黄素对LNCaP细胞增殖抑制率的影响

图2 姜黄素对LNCaP细胞自噬率的影响

2.2 姜黄素对LNCaP细胞自噬的影响 采用姜黄素(0、10、20、40 mol/L)孵育LNCaP细胞24 h后，采用western blot和RT-PCR分别检测了Beclin-1蛋白和mRNA表达的情况，结果显示，姜黄素(0、10、20、40 mol/L)剂量依赖地引起细胞自噬增加(见图3)。

图3 姜黄素对Beclin-1蛋白和mRNA表达的影响

2.3 姜黄素诱导LNCaP细胞自噬对Akt/mTOR信号通路相关蛋白的影响 采用western blotting检测了自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I、p62的表达情况，结果显示，与对照组比较，姜黄素引起LC3II/LC3I比值升高，p62蛋白表达水平下降，且呈剂量依赖性(见图4)这些结果提示姜黄素诱导LNCaP细胞自噬。检测自噬Akt/mTOR信号通路参与调控相关蛋白p-Akt，Akt，p-mTOR和mTOR的表达水平，结果发现，与对照组比较，姜黄素促进p-Akt，p-mTOR磷酸化水平下降，并呈浓度依赖(见图5)，提示Akt/mTOR通路参与姜黄素诱导LNCaP细胞自噬抑制细胞增殖。

图4 姜黄素对LCII/LCI、p62蛋白表达情况的影响

图5 姜黄素对p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR相关蛋白表达情况的影响

3 讨论

细胞自噬是目前肿瘤领域研究热点之一，自噬与肿瘤关系密切，对肿瘤发生、发展起着重要作用[6]。姜黄素是一种植物提取物，近年来姜黄素等天然化合物已成为肿瘤治疗中预防和治疗策略的研究热点。研究证实，姜黄素能阻断DAMPs-TLR4信号通路途径抑制黑色素瘤细胞的增殖及转移[10]。姜黄素还能显著降低胃癌的存活率和增殖能力，诱导细胞凋亡[11]。这些研究提示姜黄素也可能具有抑制前列腺癌细胞增殖和诱导自噬的作用，

姜黄素是植物姜黄中根茎中最具生物活性的多酚异黄酮，其显著的特点是具有抗炎和抗肿瘤特性[12-13]。大量文献已证实姜黄素对肿瘤发生发展具有化学预防作用[14]。其依据是，姜黄素多种动物肿瘤模型上表现出对致癌作用的多效性抑制作用，尤其在前列腺癌动物模型上。其涉及的关键机制可能包括：(1)小干扰RNA下调DNA结合1抑制剂的表达；(2)肿瘤抑制因子p53的修复；(3)Nrf2信号的激活[15]；(4)下调VEGF表达[16]；(5)调节toll样受体(TLR)/interleukin-1受体(IL-1R)途径；(6)转化生长因子beta1(TGF-β1)；(7)调节炎症介质，例如诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶2(COX2)；(8)通过下调Bcl-2并上调Bax促进细胞凋亡[17]；(9)抑制MMP9[16]。此外还有研究报道，姜黄素可通过调节前列腺癌细胞炎症相关通路、MAPK、JAK/STAT信号抑制前列腺癌细胞的增殖。新近研究发现，姜黄素可通过调节前列腺癌细胞自噬促进肿瘤细胞的凋亡[15]。Beclin1作为自噬的特异性标志物，与自噬过程密切相关，尤其在自噬的早期。LC3I向LC3II的转化有助于自噬体的形成，LC3II常被认为是一种自噬体标记物。本研究为了证实姜黄素对前列腺癌LNCaP细胞系的影响，首先检测了姜黄素对细胞活力和细胞自噬率，发现姜黄素抑制LNCaP细胞增殖，并发现这种抑制作用随着剂量的增加而增强，同时伴随细胞自噬的增强。

Akt/mTOR通路是研究调控细胞自噬的经典通路，特别是参与了肿瘤发生发展[7]。为了证实细胞自噬Akt/mTOR信号是否参与姜黄素对LNCaP细胞的影响，研究检测了自噬相关蛋白Beclin-1，LC3II,，LC3I，p62，p-Akt，Akt，p-mTOR和mTOR的表达情况，发现自噬相关蛋白Beclin-1，LC3II，LC3I表达上调，p62表达下调，p-Akt和p-mTOR磷酸化水平下降，这些结果提示姜黄素可能通过Akt/mTOR通路诱导LNCaP细胞自噬，这与姜黄素抑制其他类型肿瘤细胞自噬途径的文献报道一致。

综上所述，姜黄素通过抑制Akt/mTOR分子信号通路诱导LNCaP细胞自噬抑制细胞增殖，提示姜黄素是一种潜在的前列腺癌治疗的候选药物。