5株海洋石油降解菌Halomonas spp.的降解特性分析

张徐畅，陈 超，刘 秋

(大连民族大学 生命科学学院，辽宁 大连 116605)

石油是地质勘探的主要对象之一，是人类主要的能源之一，有“工业血液”之称。随着石油工业的迅速发展，在石油的勘探、开发、运输及提取过程中，石油对环境造成了很大污染，直接影响了人类的生产及生活，威胁着人类的生存与健康。全世界从20世纪初就已经开始大规模的开采石油，到2000年已经消费了约60万吨，现在每年世界石油的总产量近30多亿吨[1]。地球70%上的面积被海洋覆盖，在石油开采和运输过程中，严重污染了人类赖以生存的海洋环境。海洋石油泄漏事故发生后，进入海洋里的石油会对近海和海滨生态系统产生各种急性或慢性的巨大危害[2-3]。

解决海洋石油的油污染问题，对于保护海洋环境，保护海洋资源具有重要意义，是国家环保迫切要求解决的问题。一般来说，海洋石油污染治理有物理机械法、化学处理法和生物降解法[4]。物理方法使用围油栏，吸油材料等，是相对简单、安全、有效的溢油治理方法，适用于突发溢油的回收并控制溢油的扩散；化学方法使用消油剂、凝油剂、化学燃烧等方法快速除油。物理方法主要适用于溢油初期大量油污染的治理，但对于港口相对较低浓度的油污染，则处理效果不大；化学方法容易引起二次污染，尤其是某些消油剂的化学毒性比油的毒性还大，故此这两种方法不适用于石油污染的长期处理。生物降解法是将能降解石油的微生物投放到受污染海域，对其进行降解的污染治理方法[5]。该方法可以对大面积的污染环境进行治理，具有高效、经济、安全、无二次污染等优点，已逐步被应用到石油污染的治理工作中[6-8]。

本研究以大连新港石油污染海域海底沉积物为研究对象，以石油为唯一碳源富集样品，分离、筛选出能够降解石油的微生物类群，对分离获得的微生物进行鉴定，分析其降解特性，为今后深入研究其降解机制奠定理论基础，同时为今后海洋石油污染治理提供优良的菌株。

1 实 验

1.1 材 料

1.1.1 菌种来源

本实验室前期采集大连新港石油污染海域海底沉积物样品并进行菌株分离工作，获得了大量微生物菌种资源并建立了菌种资源库。本研究选用的5株菌株选自该菌种资源库，编号分别为P14、P22、P23、P35、P37，保藏于大连民族大学生命科学学院海洋微生物研究所。

1.1.2 培养基

(1)LB培养基。酵母浸粉5 g，胰蛋白胨10 g，氯化钠10 g，琼脂18 g，去离子水1 L，pH=7.0。

(2)人工海水培养基(ASM培养基)。NaCl 30 g，MgSO40.35 g，NH4NO31.41 g，Na2HPO44.79 g，KH2PO40.2245 g，大豆粉 1.76 g，pH调到7.2后加入100 μL微量溶液：CaCl22 mg·L-1，FeCl36H2O 50 mg·L-1，CuSO40.5 mg·L-1，MnCl2·4H2O 0.5 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 10 mg·L-1，分装至150 mL锥形瓶中，高压蒸汽灭菌(121°C，20 min)。

(3)主要溶液的配制。a) 50×TAE电泳缓冲液：于少量超纯水中加入121 g Tris和18.6 g Na2EDTA·2H2O，搅拌均匀，再加入28 mL冰醋酸，混匀后定容至50 mL。注：根据使用缓冲液浓度，适当稀释即可。b) TE缓冲溶液：吸取1 mol·L-1Tris-HCl缓冲液2.0 mL和0.5 mol/L EDTA缓冲液0.4 mL，调pH至8.0，超纯水定容至200 mL，121°C灭菌30 min。

1.1.3 仪 器

超净工作台(ZHZH-C1112C)，高压灭菌器(HVE-50)，电热恒温培养箱(HPX-9052MBE)，摇床(ZWYR-D2403)，紫外可见分光光度计(UV-1600)，冷冻离心机(H2050R)，电子分析天平(FA2004)，基因扩增仪(TP350)，潜水电泳系统(AD-160)，制冰机(SIM-F140)，凝胶成像系统(GelDoc-It310)

1.1.4 试 剂

酵母浸粉(奥博星)，胰蛋白胨(奥博星)，NaCl(科密欧)，MgSO4(科密欧)，NH4NO3(科密欧)，Na2HPO4(科密欧)，KH2PO4(科密欧)，CaCl2(科密欧)，FeCl3·6H2O(科密欧)，CuSO4(科密欧)，MnCl2·4H2O(科密欧)，ZnSO4·7H2O(科密欧)，石油醚(科密欧)，二氯甲烷(科密欧)，琼脂(赛国)，石油(中石油)，十二烷(阿拉丁)，十六烷(阿拉丁)，蒽(阿拉丁)，菲(阿拉丁)，芘(阿拉丁)，萘(科密欧)，rTaq DNA Polymerase(TaKaRa)，dNTP Mixture(TaKaRa)，10×buffer(TaKaRa)，6×DNA loadingbuffer(TaKaRa)，SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生工)，琼脂糖(生工)，Na2EDTA·3H2O(源叶)，Tris(赛国)，HCl(科密欧)。

1.2 实验过程

1.2.1 菌株活化

将菌种在LB固体培养基上进行活化，并纯化。

1.2.2 DNA提取

(1)取适量菌体加入480 μL的TE，20 μL的溶菌酶(10 mg/ml)，37 ℃温浴2 h；

(2)加入50 μL的20 %SDS和5 μL的蛋白酶K(20 μg/ml),55 ℃温浴1 h；

(3)加入550 μL的酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1的混合液，震荡10-20 min，12 000 r·min-1离心10 min，吸取上清。

(4)重复步骤3，直至无沉淀；

(5)加入两倍体积的无水乙醇于零下20 ℃放置30 min以上，12 000 r·min-1，离心5-10 min，去除上清；

(6)加入200 μL的70 %乙醇清洗DNA，12 000 r·min-1离心5 min；

(7)重复步骤6；

(8)乙醇挥发干燥后，将DNA溶解于50 μL TE缓冲液中，于零下20 ℃保存备用。

1.2.3 16S rDNA的PCR扩增

(1)本研究使用基因引物如下(5’-3’)：16S rDNA-FR：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；16S rDNA-RV：TACCTTGTTACGACTT。

(2)PCR体系(50 μL)：10×buffer 5 μL、dNTP 8 μL、Taq酶 0.5 μL、RP 1 μL、FP 1 μL、ddH2O 33.5 μL，DNA 1μL。

(3)PCR反应条件：95 ℃预变性5 min, 94 ℃变性40 s, 50 ℃退火l min, 72 ℃延伸1.5 min，72 ℃保持10 min，共循环30次。

(4)凝胶电泳验证：1)按体积称取 1 %(w/v)的琼脂糖(即1g琼脂糖加入100 mL1×TAE)，加 1×TAE 缓冲液，加热至琼脂糖完全溶解；2)冷却至 60 ℃左右，加入4S RED溶液，使其终浓度为 0.1 μL·mL-1；3)将溶液倒入制胶模板中，插入合适大小的梳子，静置冷却； 4)待凝胶完全凝固后，小心将梳子拔出，将凝胶放入电泳槽中； 5)取 4 μL提取的DNA与 2 μL 上样缓冲液(6×Loading Buffer)充分混合后加入样品孔中，以 TaKaRa 公司的DNA Marker DL2000作为分子量标准；6)100V 电泳 30 min ；7)凝胶成像仪观察并拍照；8)将16S rDNA PCR产物回收测序。

(5)釆用MEGA 7.0.14软件包构建系统发育树，对菌株的同源性及系统发育地位进行分析。

1.2.4 石油降解率的测定

将培养在LB平板上的p14、p22、p23、p35、p37五株菌株用竹签刮取到无菌液体LB培养基中，培养24 h后，使菌株生长到对数生长期，配制成分布均匀的菌悬液，使其OD值在0.45～0.55，然后对菌液离心后用生理盐水将LB培养基洗净, 用移液枪吸取2%的接种量接入0.2%石油驯化的人工海水培养基(30 mL含0.06 mL石油的驯化的人工海水培养基接入0.6 mL菌悬液)，28℃/180 r·min-1培养，设置3组平行，以不加菌的含石油培养基为空白对照(空白对照设置三组)，在摇床内培养7 d。培养结束后，每瓶培养体系中加入20 mL石油醚进行第一次提取，留上层溶液，下层溶液进行第二次提取。第二次萃取加入15 mL石油醚，第三次加入10 mL石油醚；共提取三次。每次提取需充分混匀，提取时间为20 min。将三次萃取溶液离心(10 000 r·min-1)，定容至50 mL容量瓶中。取100 μL萃取液溶于4.9 mL的石油醚中，波长225 nm下紫外检测吸光度值。

1.2.5 菌悬液OD值的测定方法

LB液体培养基为对照调零，将调配好的菌悬液置于石英比色皿内，设置λ=600，测定菌悬液的吸光度。

1.2.6 石油残留量的测定

培养结束后，每瓶培养体系中加入20 mL石油醚进行第一次提取，留上层溶液，下层溶液进行第二次提取。第二次萃取加入15 mL石油醚，第三次加入10 mL石油醚，共提取三次。每次提取需充分混匀，提取时间为20 min。将三次萃取溶液离心(10 000 r·min-1)，定容至50 mL容量瓶中。取100 μL萃取液溶于4 900 μL的石油醚中，波长225 nm下紫外检测吸光度值。

1.2.7 石油降解率的计算方法

以比色法测定各种样品的石油降解情况。

紫外比色法：225 nm条件下，测定吸光度值，根据公式(1)进行降解率的计算。

(1)

式中：Mc为对照组吸光值；M0为待测菌株处理组吸光值。

1.2.8 制定石油标准曲线

以沸程60～90 °C的石油醚为溶剂，配置成一系列的石油标准溶液，在紫外分光光度计225 nm处测定吸光度值，以光密度为纵坐标，油浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.9 降解菌对不同烃类的利用

将培养在LB平板上的p14、p22、p23、p35、p37五株菌株用竹签刮取到无菌液体LB培养基中，培养24 h后，使菌株生长到对数生长期，配制成分布均匀的菌悬液，使其OD值在0.45～0.55，然后对菌液离心后用生理盐水将LB培养基洗净，将萘、菲用二氯甲烷溶解，配成0.5 g·mL-1母液，芘用二氯甲烷配成0.25 g·mL-1母液，按0.25%(V/V)分别加入到人工海水培养基内，将蒽以0.005 g·mL-1加入到人工海水培养基内，十二烷、十六烷分别按0.5 %(V/V)接入到人工海水培养基内，以2%接种量用移液枪吸取菌悬液接种至含蒽、萘、菲、芘及十二烷、十六烷的人工海水培养基中，28 ℃/180 r·min-1培养，设置3组平行，以不加菌的含蒽、萘、菲、芘及十二烷、十六烷培养基为空白对照(空白对照设置三组)，在摇床内培养3 d。空白组为对照调零，在波长600 nm下检测吸光值。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定

菌株p14、p22、p23、p35、p37的16S rDNA基因序列的系统发育树分别如图1-图5。

图1 菌株p14 16S rDNA基因序列的系统发育树

图2 菌株p22 16S rDNA基因序列的系统发育树

图3 菌株p23 16S rDNA基因序列的系统发育树

图4 菌株p35 16S rDNA基因序列的系统发育树

图5 菌株p37 的系统发育树

以p14、p22、p23、p35、p37菌株的基因组DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，均得到长度约为l.5kb的产物，测序后比对分析发现：p14与HalomonastitanicaeBH1T相似度为100%；p22与Halomonasalkaliphila18bAGT相似度为99.70%；p23与HalomonasvenustaDSM 4743T相似度为99.92%；p35与HalomonasalkaliantarcticaCRSST相似度分别为100%；p37与HalomonaspacificaDSM 4742T相似度为99.48%。

2.2 菌株降解特性分析

本研究以石油、菲、萘、蒽、芘、正十二烷、正十六烷为唯一碳源，分别分析了5株盐单胞菌株的烃类物质降解能力，具体结果如图6和图7。

图6 各个菌株降解率比较

从图2.6中可以看出，菌株p22降解石油能力最好，降解率达到47.8%，菌株p37次之，降解率达到40.2%，菌株p14降解率为31.0%，菌株p23降解率为18.6%，菌株p35降解率最差，仅为3.8%。该研究结果表明，同一个属的不同菌株之间，石油降解性能差异较大。

图7 菌株p14、p22、p23、p35、p37对不同烷烃及芳烃的降解性能

由图7可以看出菌株p14、p22、p23、p35、p37对不同烷烃及芳烃的降解性能，菌株p14在十二烷的人工海水培养基内生长最好，对十二烷的降解能力最好；在蒽的人工海水培养基内生长最差，对蒽的降解能力最差；菌株p22在十六烷及菲的人工海水培养基内生长最好，对十六烷及菲的降解能力最好；在蒽的人工海水培养基内生长最差，对蒽的降解能力最差；菌株p23在十六烷的人工海水培养基内生长最好，对十六烷的降解能力最好；在萘的人工海水培养基内生长最差，对萘的降解能力最差；菌株p35在十六烷的人工海水培养基内生长最好，对十六烷的降解能力最好；在萘的人工海水培养基内生长最差，对萘的降解能力最差；同样的，菌株p37在十六烷的人工海水培养基内生长最好，对十六烷的降解能力最好；在萘的人工海水培养基内生长最差，对萘的降解能力最差。

3 讨 论

通过对石油降解细菌p14、p22、p23、p35、p37对石油降解率的测定，及其对芳烃蒽、萘、菲、芘和烷烃十二烷、十六烷降解性能的探究，发现5株菌株均具有石油降解能力，4株菌株的降解率在10%以上，2株菌株的降解率在40%以上，菌株p22降解石油能力最好，菌株p35降解率最差。石油降解细菌p14、p22、p23、p35、p37对芳烃及烷烃均有降解能力，p22、p23对芳烃降解性能更好，p14对芳烃的降解能力最差。菌株p14对烷烃降解能力较强，菌株p35、p37对烷烃降解能力较差。因此，对于Halomonas属的菌株，同一属的不同菌株对石油的降解性能差异较大，对不同碳源的降解偏好性也各不相同。该结果将为今后烃类物质的污染环境的微生物修复技术的开发提供性能优良的实验菌株，并为今后环境污染微生物修复治理研究提供理论基础。