Puf蛋白的功能及作用机制

王臣荣，刘 晶，刘 群*

(1.中国农业大学动物医学院，北京海淀 100193；2.农业部动物流行病学与人畜共患病重点实验室农业部国家动物寄生原虫实验室，北京海淀 100193)

大多数真核生物都严格依赖基因的表达来调控其生命周期。例如，疟原虫和弓形虫通过调控基因的表达以确保其正确的增殖和分化。基因表达调控通常在转录和转录后水平上调控，而基因转录后水平的调控比转录水平调控更快，所以机体在应对各种环境变化上，基因转录后水平的调控被认为是一种快速有效的策略。

在真核细胞中，基因的表达通常通过mRNA 3端非翻译区(3′UTR)来调控。许多mRNA 3′UTR含有与RNA结合蛋白(RBP)结合的调控元件。RBP通过作用于RNA的代谢在转录后调控中起着至关重要的作用[1]。RBP通常具有保守的基序或结构域，例如RNA识别基序、五肽重复序列、锌指、KH结构域、DEAD/DEAH框以及Pumilio/FBF结构域(Puf域)。在真核生物中Puf家族(果蝇Pumilio蛋白和秀丽隐杆线虫Fem-3结合因子合称)是一大类保守的RBP家族。Puf主要通过结合mRNA 3′UTR中的特定识别序列来控制其稳定性和翻译，从而控制各种生理过程[2]。

Puf家族至少由3个亚家族组成：①经典Puf蛋白，其结构域三维结构类似于一个新月形结构，该新月形结构以序列特异性方式与单链RNA结合。Puf蛋白结合3′UTR中含有-UGU-的核心特异性序列进而调节靶mRNA的表达，并且Puf蛋白的靶mRNA的种类或功能在进化上较为保守；②Puf-A亚家族结构域呈现L形，其通过与磷酸骨架的相互作用与RNA/DNA结合；③Nop9亚家族结构域呈现C形，其通过识别序列和RNA的结构元件来调控基因的表达。经典Puf蛋白主要位于细胞质中，而Puf-A和Nop9蛋白主要位于核仁中，并在核糖体生物发生中起作用[3-4]。但是Puf-A和Nop9蛋白在哺乳动物和原虫中的功能和机制尚未见研究报道。

各种真核生物中都表达Puf蛋白，但表达Puf蛋白的数目不同。在秀丽隐杆线虫和克氏锥虫中分别发现了11个和10个Puf蛋白。在恶性疟原虫、弓形虫和人中也分别鉴定出2个Puf蛋白[5-6]。已经有报道对Puf蛋白的多种生物学功能方面进行研究，本论文仅对已报道的哺乳动物和原虫中Puf蛋白的定位、功能及其作用机制进行总结和分析，以期为原虫新药或疫苗的开发提供新思路。

1 不同物种来源Puf蛋白的定位

富含各种基序的3′UTR控制其mRNA的命运。带有相同基序的不同mRNA可能以相似的方式受到调控[7]。这些mRNA与不同的RNA结合蛋白(RBP)相互作用形成无膜核糖核蛋白(RNP)颗粒。RNP颗粒可能控制这些mRNA的命运，RNP颗粒一般包括应激颗粒和加工体。研究表明形成应激颗粒的弓形虫表现出更高的体外生存能力，并且应激颗粒的大小和数量会影响其体外生存能力，因为许多mRNA在应激颗粒中被抑制翻译，而对寄生虫存活很重要的mRNA被增强翻译。加工体中富含mRNA衰减因子和翻译抑制的mRNA。研究发现PUM1/2定位于RNP颗粒，在氧化应激诱导的应激颗粒中发现PUM1和PUM2，并且PUM1/2也在P体中被发现，同时PUM2的过表达可以诱导应激颗粒的形成[8-9]。弓形虫拥有2个Puf蛋白，但其细胞内定位尚未研究。Puf蛋白的无序区域及mRNA的基序对RNP颗粒形成至关重要[10]，但是尚不清楚Puf的颗粒定位及颗粒溶解是否影响其功能。

2 Puf蛋白的功能

2.1 参与生命过程中不同阶段的转换

疟原虫编码3个Puf蛋白(Puf1，Puf2和Puf3)[11]。其中Puf2在配子细胞和子孢子阶段起着重要作用，PfPuf2或PbPuf2的敲除促进了有性阶段的分化，进而产生更多的雄性配子细胞[12]。PbPuf2的敲除增强了UIS2磷酸酶的表达，进而抑制了疟原虫子孢子eIF2α的磷酸化，进而导致疟原虫子孢子丧失了感染活性[13]。弓形虫的缓殖子与疟原虫的子孢子特性相似，而弓形虫Puf蛋白是否在缓殖子形成过程中发挥作用尚未见报道。

2.2 参与核糖体生成与rRNA加工

Puf蛋白在rRNA加工和核糖体生成中起重要作用。酵母NOP9是一种含有Pum重复序列的蛋白质，其对pre-18S rRNA的加工至关重要。人源Nop9影响18S小亚基核糖体RNA的产生，恶性疟原虫PfPuf3也参与核糖体的生成。人源Puf-A会影响90S核糖体前体的装配。布氏锥虫PUF7的沉默导致rRNA加工受抑制。可见不同生物Puf蛋白在体核糖体生成与rRNA加工过程中的发挥着重要且保守的作用。

2.3 其他功能

最近研究表明Puf蛋白可以调控靶mRNA的定位。酵母Puf5通过过氧化物酶体影响PEX14 mRNA的定位。Puf还在调节mRNA稳定及DNA修复中发挥作用，例如布氏锥虫PUF9稳定其靶转录本(LIGKA，PNT1，PNT)，当DNA受损时，Pum1蛋白的表达量降低，进而激活DNA修复途径对DNA进行修复[14]。小鼠肌细胞Pum2和秀丽隐杆线虫肌细胞Puf8的敲除会影响线粒体的功能[15]。Pum1和Pum2会抑制细胞周期抑制基因Cdkn1b的表达来控制小鼠身体和器官的大小[16]，由此可见，不同物种Puf蛋白除了发挥其保守功能外，还参与调控其他许多生物学过程。

3 Puf蛋白调控靶mRNA的作用机制

在疟原虫和弓形虫中，基因的翻译主要发生在细胞质、线粒体和顶质体。疟原虫大部分基因在细胞质中翻译，大约50个基因在顶质体中被翻译，只有3个基因在线粒体中被翻译。由于经典Puf蛋白的胞质定位，因此本文聚焦于胞质中基因的翻译调控。Puf蛋白调节mRNA的机制对于理解其功能至关重要。mRNA 5端帽和3端多聚腺苷尾巴对mRNA的翻译起着重要的调控作用，它们分别与eIF4E和poly(A)结合蛋白(PABP)结合，5＇端帽和3＇端多聚腺苷尾巴也可阻止mRNA的降解，将其去除后会引发mRNA降解。

3.1 靶向翻译抑制

翻译起始是基因翻译中的限速步骤。翻译起始的阻断主要通过真核起始因子(eIFs)磷酸化修饰。基因的翻译机制在疟原虫和弓形虫之间是高度保守的，eIF2α、eIF2β和eIF2γ共同形成eIF2复合物。eIF2能够结合GTP，随后与甲硫氨酸tRNA相互作用形成43S启动复合物，当43S启动复合物结合起始密码子后，eIF2结合的GTP被水解，然后eIF2B催化GDP转换为GTP，而eIF2α磷酸化阻止GDP转换为GTP。因此，eIF2α磷酸化可以阻止翻译起始。

Puf蛋白可以调节eIF2α特异性磷酸酶的表达。仅当疟原虫eIF2α去磷酸化时，疟原虫子孢子的潜伏期才被破坏进而进入肝内期。疟原虫eIF2α特异性磷酸酶尚未被鉴定，但磷酸酶抑制剂处理疟原虫子孢子增强了其eIF2α的磷酸化，这意味着疟原虫子孢子中可能存在eIF2α特异性磷酸酶。进一步研究证实疟原虫确实存在eIF2α特异性磷酸酶UIS2，Puf2缺失导致子孢子UIS2 mRNA水平升高。这些数据表明Puf2抑制疟原虫子孢子中eIF2α特异性磷酸酶表达[17]。同时Puf2的敲除导致疟原虫子孢子中的eIF2α特异性磷酸酶活性过早活化，导致其过早转化为肝内期裂殖子。综上所述，Puf2可以抑制疟原虫子孢子中eIF2α特异性磷酸酶的表达。

Puf蛋白可以与eIF4E竞争结合mRNA 5端帽结构。eIF4E与mRNA 5＇端帽结合对于翻译起始也是必需的。因为翻译起始需要mRNA环化，而eIF4G与eIF4E和Poly(A)结合蛋白(PABP)结合能够促进了mRNA的环化。研究发现非洲爪蟾Pum2与eIF4E竞争结合到mRNA 5＇端帽，这样Pum2就可通过阻止起始复合物的组装来抑制翻译，但是原虫是否存在此机制尚未见报道。

Puf蛋白调控PABP与eIF4G的相互作用。PABP在翻译调控中发挥着多种作用，从保护mRNA 5端帽到与CNOT复合物相互作用来调控mRNA的翻译。eIF4G和eIF4A通过eIF4E与5端帽结合，eIF4G可以结合PABP进而导致mRNA发生环化进而启动翻译[18]。酵母Puf5p和秀丽隐杆线虫FBF-2可以干扰Pab1p-eIF4G的相互作用进而抑制靶mRNA翻译。尽管在疟原虫子孢子的应激颗粒中发现了Puf2和PABP，但尚不清楚疟原虫Puf蛋白是否干扰eIF4G与PABP相互作用。

Puf蛋白与其他蛋白质或microRNA的相互作用。果蝇胚胎Nos促进Pum与靶mRNA的结合。与Pum2或Nos3的单一作用相比，Pum2和Nos3共同作用对SIAH1的抑制更明显，这表明Nos3可以加强Pum2对靶mRNA的抑制作用[19]。恶性疟原虫7-Helix-1与已知的翻译阻遏物(例如DOZI，CITH和Puf2)互作[20]，但是它们的功能是否叠加尚不清楚。TgAlba1和TgAlba1是RNA结合蛋白，TgAlba2的翻译需要TgAlba1的表达。人源Pum1对p27的抑制作用是通过miRNA-miR-221和miR-222来实现的。

Puf蛋白可以调节靶mRNA的定位。酵母Puf6可以调节ASH1 mRNA的定位进而调控翻译。Puf3可协助靶mRNA定位于线粒体[21]。

3.2 靶向mRNA的降解

去腺苷酶可以降解mRNA的多聚腺苷尾，这通常是mRNA降解中的限速步骤。该过程涉及CNOT复合物的活性，CNOT复合物是高度保守的多亚基复合物，其可协助调控基因的表达。CNOT包含两个进化上保守的去腺苷酶Ccr4，CAF1及支架蛋白Not1。CNOT去除多聚腺苷尾后，mRNA的环结构被破坏，导致去帽激活因子DHH1与Not1缔合，进而招募DCP1-DCP2去帽复合物[22]。

mRNA去腺苷化后进行脱帽和降解。酵母Puf5p可以结合Pop2p，随后将Ccr4p募集到目标mRNA并对其去腺苷化。线虫和人的Pum也和Pop2p相互作用，酿酒酵母Puf3可以通过募集CNOT和DHH1p来激活靶mRNA的去腺苷化[23]，推测Puf与CCR4-NOT复合物互作是一种保守的机制。但在原虫中未发现此种机制，有待于进一步研究。

总之，Puf可以通过多种机制来影响目标转录本的稳定性，例如，①通过抑制翻译起始复合物的形成，与其他蛋白质和microRNA的相互作用以及靶向mRNA的定位来抑制翻译。②通过与CCR4-NOT去腺苷酶复合物的相互作用进行去腺苷化进而引起的靶mRNA降解，Puf还可以增加靶标mRNA的稳定性并增强翻译，其机制需要进一步阐明。

4 Puf蛋白活性的调控

Puf活性可以被胞质非编码RNA(ncRNA NORAD)调节，NORAD转录本富含Puf结合基序并被认为是Puf竞争性结合抑制剂。缺乏NORAD转录本，Puf在有丝分裂和线粒体功能中的活性将增强[24]。同时Puf蛋白也可以抑制NORAD的表达，这表明Puf-NORAD存在反馈回路[25]。

Puf蛋白还能够结合靶mRNA基序之外的序列。Puf结合靶mRNA的“UGU”核心基序进而对其进行调控。但是核心基序外部序列的变化也可能导致Puf对靶mRNA的差异调节。人源Pum1的目标识别序列与Pum2的不同，这可能是由于核心基序外部序列不同所致[26]。

在转录和翻译后水平上调节Puf蛋白。肌肉细胞增强因子2已被证明在果蝇中调节Pum启动子活性，还发现Mef2诱导miR-134的表达进而下调Pum 2，药物也可以调控果蝇Pum启动子的活性[27]。果蝇Pum还受一类保守的RNA结合蛋白Fox(Rbfox1)的调控。Rbfox1的缺失会导致Pum mRNA和蛋白质水平增加。

翻译后修饰来调节Puf蛋白的活性。当葡萄糖缺失时，酵母Puf3发生的磷酸化，而Puf3的磷酸化可将靶mRNA的命运从降解转化为翻译激活[28]。由此可见，转录因子、非编码RNA、RBP和磷酸化修饰参与Puf蛋白活性的调控。

5 展望

虽然基因的转录后调控是消耗能量的，但其可以快速地对外界压力做出反应来缓解压力。当然蛋白修饰对刺激能做出更快的反应，但是其消耗能量更多及过早表达某些蛋白会阻止某些原虫的阶段转化。Puf蛋白家族是真核生物中重要的基因转录后调控因子，其可以参与调控不同的生物学过程，同时Puf的表达也受许多信号的调节。论文重点概述了人和原虫中经典Puf蛋白的定位、生物学功能以及作用机制，希望能够为原虫Puf蛋白的研究提供可借鉴的资料，以期为原虫新药或疫苗的开发提供新思路。