一起犊牛冠状病毒、轮状病毒与大肠埃希氏菌混合感染的实验室诊断

金 剑，尹 峥，张 琪，许信刚

(1.西北农林科技大学 动物医学院，陕西杨凌 712100；2.安徽农业大学 动物科技学院，安徽合肥 230036)

能引起新生犊牛腹泻的主要病原为多种肠道病原体，如病毒、细菌、寄生虫[1-2]。其中牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)和牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)被认为是与犊牛腹泻有关的最重要的肠道病毒，常常共同感染犊牛[3]，使得胃肠道功能紊乱、导致机体脱水、酸中毒、病情严重的可导致犊牛死亡，普遍流行在规模化牛场中，给畜牧业造成巨大的经济损失[4]。尽管多数大肠埃希氏菌是非致病性的，但是有些致病性大肠埃希氏菌特别容易感染刚出生不久的犊牛，使其表现为水样腹泻[5-6]。2019年12月，陕西省某规模化奶牛场新生犊牛发生一起水样腹泻，2 d～3 d后有5头犊牛死亡。为确定犊牛死亡的病因，无菌采集病死犊牛的肝脏和肠内容物等进行实验室检测。结果表明，这起犊牛腹泻是由BCoV、BRV和大肠埃希氏菌混合感染引起，现将结果予以报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 陕西省某规模化奶牛养殖场发生腹泻死亡的5头犊牛，剖检无菌采集5头犊牛的肝脏及脾脏混合样品5份，采集犊牛小肠容物5份。

1.1.2 培养基和试剂 细菌常用培养基、靛基质试剂、革兰氏染液等按文献[7]介绍的方法制备；药敏纸片自杭州滨和微生物试剂有限公司购买。

1.1.3 仪器设备 高速冷冻离心机(D3024R)，美国贝克曼股份有限公司产品；立式压力蒸汽灭菌器(LS-50HJ)，江阴滨江医疗设备有限公司产品；凝胶成像分析系统(GenoSens 1800)，北京赛智创业科技有限公司产品；电子天平(DTC)，亚津电子科技公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离 无菌取肝脏深部组织置于添加100 mL/L犊牛血清的普通培养基中，37℃培养24 h后。培养物划线接种于麦康凯培养基；挑取可疑菌落进行革兰氏染色，显微镜下观察染色结果。

1.2.2 细菌生化试验 将分离菌培养物接种到细菌生化编码鉴定管中，37℃恒温培养箱中培养24 h，观察试验结果。

1.2.3 药敏试验 按文献[7]介绍的K-B法操作及判定。

1.2.4 小鼠致病性试验 健康小白鼠10只，随机分成2组，第1组腹腔注射分离菌菌液0.2 mL/只(1×108CFU/mL)，第2组注射生理盐水作为对照0.2 mL/只。在室温条件下，隔离饲养，每日观察小鼠存活状况。小鼠死后立即无菌剖检，观察器官的病变，并将肝、脾进行涂片染色镜检。

1.2.5 引物设计与合成 参考文献[8-10]牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒基因设计特异性引物，见表1。引物委托奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

表1 引物信息

1.2.6 病毒RNA提取、RT-PCR鉴定 肠内容物离心取上清，按照TRIzol法提取总RNA，RNA反转录为cDNA。以获得的cDNA为模板，采用表1的引物进行PCR反应扩增。

2 结果

2.1 细菌分离培养及革兰氏染色结果

在麦康凯琼脂培养基上可见单个圆形、扁平、湿润、表面光滑、边缘整齐的红色菌落(图1)。分离菌株革兰氏染色后，在显微镜下可观察到红色、形态为短杆状、两端圆滑并稍弯曲的杆菌。(图2)，符合大肠埃希氏菌生长特性。

图1 麦康凯琼脂培养基菌落形态

图2 革兰氏染色镜检(1 000×)

2.2 生化试验结果

分离菌培养物接种到细菌生化编码鉴定管中，37℃恒温培养箱中培养24 h，参照文献[11]的标准，该菌的生化分析结果(见表2)均符合大肠埃希氏菌特性，因此分离菌为大肠埃希氏菌。

表2 分离菌株生化反应结果

2.3 PCR鉴定结果

PCR鉴定结果显示，5份样品BVDV均为阴性(图3)；有4份样品BCoV为阳性(图4)；5份样品BRV为阳性(图5)。4份样品被鉴定为BCoV和BRV共同感染。

M.DNA标准DL 5 000；1～5.被检测样品；6.阴性对照

M.DNA标准DL 5 000；1～5.被检测样品；6.阴性对照

M.DNA标准DL 5 000；1～5.被检测样品；6阴性对照

2.4 小鼠致病性试验结果

小鼠于感染后8 h出现精神沉郁，行动迟缓，食欲减退等症状，在12 h全部死亡，对照小鼠无异常。剖检小鼠，取肝脏进行细菌分离培养鉴定，确定从死亡小鼠分离到的是大肠埃希氏菌。

2.5 药敏试验结果

用14种抗菌药敏纸片对分离到的大肠埃希氏菌进行药物敏感性试验。试验结果如表3。

表3 大肠埃希氏菌对17种抗菌药物的敏感性检测

3 讨论

犊牛腹泻是一种多因素综合征，具有易感因素(年龄、遗传、营养和免疫学因素)，并且主要是单一或混合感染的病原体，例如病毒，细菌和寄生虫，犊牛腹泻被认为是全世界犊牛的重要健康问题[12-13]。在世界范围内，牛冠状病毒(BCoV)、轮状病毒(BRV)和大肠埃希氏菌被公认为是犊牛急性腹泻中最重要的肠病原体[3]。本次研究检测的5份肠内容物中有4份样品混合感染BRV和BCoV。进一步对肝脏进行细菌分离鉴定，以鉴定是否存在其他病原体，例如大肠埃希氏菌。本研究从肝脏分离出的大肠埃希氏菌，经小鼠致病试验和药敏试验可知，该大肠埃希氏菌致病性强且耐药性强，仅对诺氟沙星、左氟沙星和多粘菌素B中度敏感，对其他临床常用药物均耐药。抗生素通常用于治疗新生犊牛腹泻，但过量使用也会与对人类和动物健康以及对环境产生不利影响，如导致致病菌耐药性及多重耐药性提高[14]。本次研究的意义在于，一旦临床上发生的类似牛冠状病毒、牛轮状病毒和大肠埃希氏菌混合感染，要及时发现并治疗，善于总结经验，为制定抗菌药物使用提供重要依据，对预防和治疗此类感染以及科学用药具有重要意义。