番茄红素对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠抗糖尿病作用及机制

张丹 潘思影 张会峰 尚进

(1郑州澍青医学高等专科学校，河南 郑州 450064；2河南省人民医院内分泌科；3郑州大学第一附属医院肾脏内科)

糖尿病是一种以高血糖为主要特征的慢性代谢性疾病之一〔1,2〕。机体长期的慢性高血糖耐受会诱导机制脂质和蛋白代谢紊乱，进而诱发多种肾脏、心血管等多组织并发症，进而对人体健康、寿命、生活质量等构成严重威胁。近来有研究表明，糖尿病是一种自身免疫性和慢性炎症性疾病；长期的高血糖会引起血管内皮细胞损伤，进而诱发机体产生氧化应激、炎症等多种病理性变化〔3～5〕。因此，糖尿病相关的炎症和氧化应激相关研究已经成为糖尿病治疗的一个新靶点。虽然西药在血糖控制方面具有显著疗效；但是长期使用化学药物不仅会使得患者产生耐药性，还会造成恶心、厌食、肝肾功能损伤等多种毒副作用，且价格昂贵。然而，中药在糖尿病的治疗过程中具有悠久历史，能够显著改善糖尿病患者机体状况，并能够显著改善患者的并发症和毒副作用〔6～9〕。因此，中药在糖尿病的治疗中具有非常广阔的前景。例如，文献表明芒果苷和苦瓜果汁等能够显著改善链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠体重降低、血糖和自由基升高，并能够显著改善机体血脂，具有抗炎、增强免疫等多种药理活性〔10～11〕。番茄红素是从茄科植物提取出来的一种非常重要的类胡萝卜素，其具有抗糖尿病作用，但是作用机制仍不清楚。因此，本研究通过番茄红素处理糖尿病大鼠8 w后，检查糖尿病大鼠体重及血糖等指标的变化，并测定机体氧化应激及炎症因子相关指标，探究番茄红素抗糖尿病的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性SD大鼠60只，体重为(220±20)g，均由河南省动物实验中心提供〔SYXK(豫)2017-0006〕。实验大鼠均饲养恒温(25℃)、恒湿(50%±5%)环境下统一饲养〔SYXK(豫)2017-0021〕，并且保证动物饲养间通风、干燥，昼夜12 h循环。本实验方案设计及操作均经过河南省人民医院伦理委员会审批，伦理审查编号：LACUC-20170106025。本实验操作遵循3R原则。

1.2主要试剂与仪器 番茄红素和STZ均购买自美国Sigma 公司(美国)；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和IL-6试剂盒均购买自北京索莱宝科技有限公司(北京，中国)；核因子(NF)-κB p-65、p-核因子-κB抑制剂激酶(IKK)β、核因子(IKK)β、p-IκBα和IκBα一抗、荧光二抗购买自大连 Takara 公司(大连，中国)。聚合酶链反应(PCR)试剂盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购买自南京建成生物科技公司(南京，中国)。

低温离心机(Allegra X-30R，Beckman，美国)；CX41荧光显微镜(德国Olympus公司)；RM22335型石蜡切片机(德国Leica公司)；酶标仪(iMark，Bio-Rad，美国)。

1.3实验方法

1.3.1动物模型的制备 实验大鼠适应1 w后，开始给予高脂、高糖饮食连续8 w后，腹腔注射给予STZ〔60 mg/(kg·d)〕连续2 d，以制备糖尿病大鼠模型〔12〕。并分别在72 h和3 d后测定试验大鼠的空腹血糖，当实验大鼠空腹血糖持续高于16.7 mmol/L时，表明糖尿病实验大鼠模型复制成功。

1.3.2实验分组及给药 将造模成功的试验大鼠随机分为3组(n=15)：模型组、番茄红素低剂量组(15 mg/kg)和番茄红素高剂量组(30 mg/kg)。另取15只健康大鼠作为正常组。分组后，正常组试验大鼠和模型组试验大鼠通过灌胃给予相应的生理盐水，而给药组则通过灌胃给予相应剂量的番茄红素，连续给予8 w。

1.3.3血清生化指标的测定 连续给药8 w后，测定实验大鼠的体重和空腹血糖；然后采用水合氯醛将试验大鼠麻醉后，腹主动脉取血，室温放置1 h后，在4℃、3 000 r/m条件下离心15 min；取上清，用于测定SOD、GSH-Px、CAT酶活力与MDA含量及血清中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平变化；在所有生化指标的检测过程中，所有操作严格按照相应试剂盒的说明书进行，以保证实验结果的可靠性与可重复性。

1.3.4HE染色观察试验大鼠肾脏组织形态变化 每组试验大鼠取3只，经10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，采用4%多聚甲醛溶液(PFA)进行灌流，取出肾脏组织，4% PFA固定24 h后，经脱水处理后进行常规的包埋、切片，厚度约4 μm。进行常规HE染色后在光学显微镜下观察各组实验大鼠肾脏组织的病理学变化。

1.3.5Western印迹检测肾脏组织中相关蛋白的表达 称取适量肾脏组织，加入组织裂解液，在冰浴上放置2 h，然后在4℃、3 500 r/min条件下离心10 min后取上清；并按照BCA法测定各组织提取液中的蛋白浓度。然后加入缓冲盐溶液，沸水浴加热10 min使得蛋白变性；然后进行十二烷基苯磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)以分离目的蛋白，然后将其转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在摇床上采用TBST洗膜5 min×3次，然后采用5%的胎牛血清(BSA)封闭2 h后加入相应的一抗，并保持在避光、4℃的条件下孵育过夜；在采用TBST洗膜5 min×3次。然后，加入荧光二抗在避光、4℃的条件下孵育2 h。在采用TBST洗膜5 min×3次后，使用Image Studio软件分析目的蛋白的相对灰度值。

1.4统计学方法 使用SPSS19.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1一般状况及血糖、肾脏指数的变化 正常组试验大鼠的精神状态良好，饮食、饮水量正常，皮肤毛色有光泽；而模型组大鼠精神萎靡，出现了明显的“三多一少”的临床特征，并且毛色干枯、稀疏；当给予番茄红素后，其精神状态、毛色和日常的饮食、饮水量均明显好转，逐渐回调。当连续给予番茄红素8 w后，与正常组大鼠相比，模型组大鼠的体重显著降低(P<0.01)，血糖水平和肾脏指数均显著升高(P<0.01，P<0.05)；而给药组大鼠体重、血糖和肾脏指数均明显回调(P<0.01，P<0.05)，表明番茄红素对于糖尿病引起的体重降低、血糖和肾脏指数升高具有明显改善作用。见表1。

表1 各组体重、血糖和肾脏指数的变化

2.2各组肾脏组织的病理学变化 经过HE染色后可以明显观察到，正常组肾脏组织未出现异常，可以观察到完整的肾小球结构。而模型组肾脏组织则呈现出明显的病理损伤特征，肾小球体积增大、系膜增生，可以观察到肾小球上皮细胞呈现空泡并呈现淋巴细胞浸润。当给予番茄红素后，其病理学特征均得到明显改善，并呈现剂量依赖性；表明番茄红素能够改善糖尿病导致的肾脏组织损伤。见图1。

图1 番茄红素对糖尿病模型大鼠肾脏组织的影响(HE，×200)

2.3各组肾脏组织中氧化应激水平比较 与正常组相比，模型组SOD、CAT和GSH-Px活性均显著降低(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.05)，表明模型组大鼠机体组织处于过氧化应激状态；当给予番茄红素后，肾脏组织中SOD、GSH-Px、CAT酶活性和MDA水平均显著回调(P<0.05)，表明番茄红素对STZ诱导的糖尿病模型大鼠氧化应激损伤具有一定的保护作用。见表2。

2.4各组血清炎症因子水平比较 与正常组相比，模型组血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平均显著升高(P<0.01)，表明实验大鼠机体处于过炎症状态；当连续给予番茄红素8 w后，STZ诱导的糖尿病大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6均显著降低(P<0.05，P<0.01)，且番茄红素高剂量组更加趋近正常组，表明番茄红素对于STZ诱导的糖尿病大鼠血清炎症因子水平异常升高具有明显的改善作用。见表3。

表2 番茄红素对糖尿病大鼠血清中氧化应激相关指标的影响

2.5IKK/IKB/NF-κB信号通路 与正常组相比，模型组肾脏组织NF-κB p65、p-IKKβ/IKKβ和p-IKBα/IKBα蛋白含量显著增加(P<0.05)，表明糖尿病大鼠机体处于炎症状态，IKK/IKB/NF-κB信号通路被激活；当给予番茄红素后，给药组中的NF-κB p65、p-IKKβ/IKKβ和p-IKBα/IKBα蛋白含量均发生显著回调，表明番茄红素对于糖尿病模型大鼠肾脏组织的炎症反应具有显著抑制作用；番茄红素能够显著抑制IKK/IKB/NF-κB信号通路活化。见图2、表4。

表3 番茄红素对糖尿病大鼠血清中炎症因子的影响

1～4：正常组、模型组、番茄红素低剂量组、番茄红素高剂量组图2 番茄红素对糖尿病大鼠肾脏组织IKK/IKB/NF-κB信号通路的影响

表4 番茄红素对糖尿病大鼠肾脏组织IKK/IKB/NF-κB信号通路的影响

3 讨 论

近年来，随着经济的飞速发展，人们的生活生平和饮食结构均发生了巨大变化，糖尿病发病率也正在逐年升高，对人们的生命健康和生活质量带来了巨大危害〔13,14〕。目前研究表明，机体长时间处于高血糖状态，会诱发机体发生病理性的生理变化，如氧化应激损伤、炎症反应等〔15,16〕。此外，糖尿病患者通常也伴随着脂质代谢异常，进而导致机体氧自由基产生过多，诱发机体处于氧化应激状态。糖尿病与自身炎症和氧化应激损伤具有密切的关系；因此，糖尿病相关的炎症反应和氧化应激相关研究已经成为当前减缓、治疗糖尿病及其并发症的新靶点。

番茄红素是一种广泛存在于茄科植物中的类胡萝卜素，大量研究表明其具有抗氧化等生物活性。本研究也已证实，番茄红素能够显著改善糖尿病大鼠体重异常降低和血糖水平、肾脏指数的异常升高；并能够显著抑制糖尿病大鼠机体氧化应激水平。炎症反应是机体免疫系统的一种防御机制，但是长期的慢性炎症状态则会导致机体发生病理性损伤；糖尿病是一种慢性的低度炎症，血清中的TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子水平是监控和评价机体炎症状态的重要指标〔17,18〕；本研究发现番茄红素能够显著抑制TNF-α、IL-1β和IL-6升高。此外，氧化应激还可激活NF-κB等多个参与炎症反应的信号通路，并且IL-1β水平过高，也可激活NF-κB等信号通路；进而导致大量的细胞质蛋白复合物活化，产生IκB激酶复合物，加重机体炎症反应〔19～23〕。本研究发现，当连续给予番茄红素8 w后，其NF-κB p65、p-IKKβ和p-IKBα蛋白含量显著降低，表明番茄红素能够抑制IKK/IKB/NF-κB信号通路。

综上，番茄红素能够显著改善糖尿病模型大鼠的体重降低、降低血糖水平、改善机体炎症水平和氧化应激损伤，并能够显著改善肾脏组织损伤和细胞凋亡；其作用机制可能是通过抑制IKK/IKB/NF-κB信号通路活化进而发挥作用的。