HPLC法测定复方金银花颗粒中木犀草苷的含量

孔凡建 刘然

摘要：目的建立一种高效液相色谱法来测定复方金银花颗粒中木犀草苷的含量。方法采用Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6×250mm，5μm）为色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸水溶液（20∶80）为流动相，柱温30℃，检测波长为350nm，流速为1.0 mL/min，进样量为10μL。结果在上述色谱条件下，复方金银花颗粒中木犀草苷的含量在2.4076～38.5220μg·mL-1（R=0.9998）线性关系良好（R=0.9998），回归方程为y=25.69x-18.127，测得平均加样回收率为100.13%，RSD为1.48%（n=9）。结论所建立的方法简便准确，可用于测定复方金银花颗粒中木犀草苷的含量，可为其质量控制与评价提供参考。

关键词：复方金银花颗粒;木犀草苷;高效液相色谱;含量测定

中图分类号：R927.11文献标志码：B文章编号：1007-2349（2021）02-0071-04

复方金银花颗粒由金银花、连翘、黄芩三味中药组成，具有清热解毒，凉血消肿的功效，用于风热感冒，喉痹，乳蛾，目痛，牙痛及痈肿疮疖等症[1]。处方中金银花和连翘均为清热解毒类中药的代表，两者均有清热解毒的功效，在抗菌、抗炎、抗病毒等方面效果显著[2]。黄酮类的木犀草苷和有机酸类的绿原酸是金银花中重要的活性成分，也是对其进行质量评价时的指标成分。其中，木犀草苷具有较强的杀菌消炎，解热镇痛的功效，在抗病毒和抗肿瘤方面表现出较好的作用[3]，也具有较低的肝毒性，对肝细胞有保护作用。2005年版《中国药典》把木犀草苷的含量列为了金银花质量的评价标准之一，并且首次确定了对金银花药材采用高效液相色谱法测定其中木犀草苷的含量;连翘中主要成分为连翘酯苷、连翘苷、皂苷等，有研究从注射用双黄连（冻干）的连翘中共分离得到了39个化合物，黄酮类化合物有8个，其中就包含木犀草苷，说明连翘中也含木犀草苷[4];黄芩中富含多种黄酮类化合物，其中包括黄芩苷及黄芩素等，但尚未报道其是否含有木犀草苷。黄芩具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗肿瘤，心血管保护、抗高血糖及预防并发症等作用[5]。

复方金银花颗粒现收载于《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂·第十册》（WS3-B-1985-950），标准中仅收载有对该制剂进行理化鉴别，黄芩苷的薄层色谱鉴别项以及常规检查的方法，尚未收载含量指标测定的方法，不利于质量控制。通过查阅相关文献，发现目前已有一些学者对复方金银花颗粒研究、建立了多种有效成分含量测定的方法。比如：何悦[6]、范婉思[7]、唐励静等[8]运用HPLC法对其中10余种成分的含量进行了测定，为复方金银花颗粒的生产工艺、质量保证提供了理论依据;杨志雄等[9]运用RP-HPLC法对其中的黄芩苷进行了含量测定，但相关资料中并未发现复方金银花颗粒中的木犀草苷含量测定的具体方法。因此，为提高该制剂质量标准，本文以木犀草苷为复方金银花颗粒的含量指标，建立高效液相色谱法测定复方金银花颗粒中木犀草苷的含量。

1材料

1.1仪器Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm）色谱柱;Agilent高效液相色谱仪（型号：1260 Infinity）;北京赛多利斯BP211D电子分析天平;北京赛多利斯MSE224S-11CE-DU电子天平;上海必能信CPX5800H-C超声波清洗仪;Carry60紫外分光光度计（安捷伦科技-中国有限公司）。

1.2试药与试剂木犀草苷对照品（批号：111720-201810，含量：93.5%，中国食品药品检定研究院）;复方金银花颗粒（厂家：广州诺金制药有限公司，批号：0271203、0271221、0271246，规格：10 g/袋，相当于总药材3.5 g）;乙腈、甲醇为色谱纯（默克股份两合公司），无水乙醇、磷酸为分析纯（四川西陇科学有限公司）;水为纯化水。

2方法与结果

2.1色谱条件与系统适用性试验色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6×250mm，5μm）;以乙腈-0.1%磷酸水溶液（20∶80）为流动相;柱温为30℃;流速为1.0 mL/min;检测波长350nm;进样体积为10μL。在此色谱条件下，供试品溶液B的色谱图与对照品溶液A的色谱图在相应保留时间处显相同的峰，阴性对照品溶液C与对照品溶液A相应的保留时间内未出现色谱峰，色谱图见图1。

2.2溶液的制备取木犀草苷对照品10mg，精密称定，置于100 mL的棕色量瓶中，加入70%乙醇30 mL，超声溶解，用70%乙醇稀释至刻度线，摇匀，即得100μg/mL的对照品贮备液，放在阴凉避光处进行保存，备用。精密量取1 mL对照品储备液，用70%乙醇稀释并定容至10 mL容量瓶中，摇匀，得到对照品溶液。

取装量差异项下的复方金银花颗粒，研细，取约3 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定重量，超声处理（功率350W，频率50kHz）20 min，放至室温，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，即得供试品溶液。

按处方比例稱取不含金银花和连翘的其它药材，按其制法制备阴性制剂，依法制备成阴性对照品溶液。

2.3方法学考察线性关系考察：精密量取对照品储备液0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为2.5、5、10、20、30、40μg/mL的溶液，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图。以木犀草苷对照品浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明对照品浓度为2.4076μg/mL～38.5220μg/mL的范围内木犀草苷对照品的浓度和峰面积呈良好的线性关系，其回归方程为：A=25.69C-18.127，R=0.9998（n=6）。

精密度试验：精密吸取上述对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，进样量10μL，记录木犀草苷峰面积。结果木犀草苷的平均峰面积为253.20802，峰面积的RSD为0.23%（n=6），表明仪器的精密度良好，满足测定要求。

重复性试验：取同一批次样品（批号：271203）6份，分别按“2.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.1”中所叙述的条件进行测定，对检测得到的峰面积进行记录，根据回归方程计算木犀草苷的含量，结果木犀草苷的平均含量为0.1257mg/g，含量的RSD为0.99%（n=6），表明该方法重复性较好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液于0、2、4、8、12、24小时进样测定，每次进样10μL，对检测到的峰面积进行记录，计算木犀草苷的含量。结果木犀草苷的平均含量为0.1253mg/g，含量的RSD为0.25%（n=6），表明依上述方法制备的样品溶液在24 h内变化不明显，测定结果较稳定，能够满足正常测定需要。

加样回收试验：精密称取已知含量的样品（批号为0271203，每份约1.5 g）9份，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，分别在1、2、3号样品中精密加入木犀草苷对照贮备溶液1.0 mL，在4、5、6号样品中精密加入木犀草苷贮备溶液2.0 mL，在7、8、9号样品中精密加入木犀草苷贮备溶液3.0 mL，依法得到供试品溶液，按上述色谱条件进样进行检测，记录色谱图，计算得复方金银花颗粒中木犀草苷的回收率。结果木犀草苷的平均回收率为100.13%，RSD=1.48%（n=9），详见表1。

样品含量测定取3个不同批次的复方金银花颗粒（批号为271203、271221、271246），每批平行2份，依法制备供试品溶液，按拟定色谱条件进样测定峰面积，并计算样品中木犀草苷的含量，结果见表2。

3结论与讨论

3.1检测波长的选择取木犀草苷对照品适量，用70%乙醇配制成3μg·mL-1木犀草苷对照品溶液，照紫外-可见分光光度法（《中国药典》2015版四部），在200～600nm范围下扫描，如图2，结果显示木犀草苷紫外最大吸收为350nm，参考文献、药典及实验结果，确定检测波长为350nm。

3.2耐用性试验本研究选用C18柱进行检测，实验中考察了不同品牌的C18色谱柱的分离效果，Phenomenex luna C18（250×4.6mm，5μm），汉邦Kromasil C18（250mm×4.6 mm，5 μm），Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm），结果木犀草苷在三种色谱柱的分离度分别为1.85、1.61和2.12，分离度均大于1.5，结果表明不同品牌的色谱柱均能满足检测的需求。

3.3提取溶剂和时间选择试验通过比较70%甲醇50 mL、70%乙醇50 mL作为提取溶剂，超声提取20min，测定木犀草苷含量，发现两种溶剂提取测得木犀草苷含量无差别，同时，对比25 mL70%乙醇和50 mL 70%乙醇，发现加入50 mL70%乙醇后，木犀草苷提取率相对较高，因此，最终选择70%乙醇50 mL作为溶剂。试验还考察了加入70%乙醇后分别超声10min、20min和30min对测定结果的影响，结果显示超声10min，测定木犀草苷的含量偏低，超声20min和超声30min，测得样品中木犀草苷的含量基本一致，考虑到节省时间，因此选择超声20min。

目前，国内市场上已有30多家获批生产药企生产复方金银花颗粒，但是《中国药典》还未将复方金银花颗粒收载记录，现行标准中对其有效成分的含量测定并未收载检测方法，缺少对主要有效成分的指标控制。金银花和山银花的化学成分、药理作用有所差别，金银花中木犀草苷的含量高于山银花，解热抗炎效果也比山银花好，山银花和金银花的价格相差较大，部分商人为谋取更大的利润，用山银花代替金银花，临床用药时出现药效不足、用药过多等问题[10]。为避免用山银花代替金银花来使用的现象，有必要对该制剂中木犀草苷的含量进行检测，以控制金银花的质量而使该制剂的质量标准有所提高。

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（收稿日期：2020-07-15）