shRNA沉默软骨素聚合因子基因对脑胶质瘤细胞活性的影响

吴海涛 陈小忠 赵洪新 申昊 杨朝志 岳翔 张平 王培

(遵义医科大学附属医院神经外科，贵州 遵义 563000)

脑胶质瘤是中枢神经系统发病率最高的恶性肿瘤，具有高增殖性、侵袭性及易复发的特点〔1〕。目前临床治疗以手术联合放化疗为主，但预后较差，患者5年生存率很低〔2〕。虽然脑胶质瘤的发病机制尚未完全明确，但研究者已发现脑胶质瘤属于多基因异常性疾病〔3〕，原癌基因的高表达和抑癌基因缺失共同导致了肿瘤细胞的异常调控机制〔4〕。软骨素聚合因子(ChPF)是一种由多种氨基酸构成的跨膜蛋白，在结肠癌、头部鳞状细胞癌中存在高表达，且可能介导肿瘤的发生、发展〔5〕。ChPF蛋白在脑胶质瘤组织中表达水平明显高于正常脑组织〔6〕；本实验以此为基础，并结合相关文献〔7～9〕，推测ChPF高表达可能提升脑胶质瘤细胞活性，其作用机制可能与调控单核细胞趋化蛋白(CCL2)有关。本研究通过重组慢病毒质粒转染技术下调人脑胶质瘤A172细胞中ChPF表达，观察对细胞增殖、侵袭的影响，并进一步下调细胞中CCL2表达，探讨ChPF对CCL2表达的单向调控机制。

1 对象与方法

1.1主要材料与试剂 人脑胶质瘤细胞系A172购于上海慧颖生物科技有限公司。携带绿色荧光蛋白的载体构建ChPF-shRNA及其阴性对照Nc-shRNA重组慢病毒质粒购于博格隆(上海)生物技术有限公司；CCL2-shRNA及其阴性对照Nc-shRNA重组慢病毒质粒购于上海英骏生物技术有限公司；胎牛血清、DMEM培养基购于沃卡威(北京)生物技术有限公司；Lipofectamine 3000购于上海索宝生物科技有限公司；CCK-8、Trizol试剂购于武汉艾美捷科技有限公司；鼠抗人ChPF、CCL2、β-actin单克隆抗体购于上海宇淳生物科技有限公司。

1.2重组慢病毒转染细胞及验证 使用携带绿色荧光蛋的载体构建的重组慢病毒转染人脑胶质瘤A172细胞，分为空白对照组、Nc-shRNA组、ChPF-shRNA组。主要步骤为：取对数生长期的A172细胞，按1×106/孔接种于6孔板中，使用含10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养；观察细胞融合度超过30%时加入慢病毒转染，继续培养72 h后在荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白表达情况，计算荧光细胞所占比例，超过80%后进行后续实验。同时使用RT-PCR和Western印迹检测细胞中ChPF mRNA和蛋白表达水平，其中RT-PCR的ChPF上游引物序列：5′-GAGGACCATGCACGCAAGG-3′，下游引物序列5′-CCATAAGGTCGTGGTAGGGGC-3′。

1.2.1CCK-8法检测细胞增殖水平 将3组细胞按1×103/孔接种于96孔板中，每孔含100 μl细胞悬液，设置5个复孔，37℃ 5%CO2浓度的细胞培养箱中培养，采用CCK-8法分别测定培养12 h、24 h、48 h、72 h、96 h的细胞增殖活性，具体为：检测前2 h每孔键入20 μl的CCK-8溶液，常规培养2 h，上酶标仪读取450 nm处每孔的吸光度值。

1.2.2流式细胞术检测细胞周期及凋亡水平 75%乙醇固定3组细胞，加入浓度为1 mg/ml的核糖核酸酶(RNase) A溶液300 μl，常规培养40 min，加入碘化丙啶700 μl，混合均匀后在4℃避光环境中染色30 min，上流式细胞仪检测各细胞周期分布情况。使用上样缓冲液洗涤3组细胞，重悬后收集沉淀，再使用200 μl缓冲液重悬细胞，滴加10 μl膜联蛋白(Annexin)Ⅴ-FITC，4℃避光环境中静置20 min，滴加10 μl碘化丙啶，上流式细胞仪检测细胞凋亡水平。

1.2.3Transwell细胞侵袭能力检测 收集转染48 h的3组细胞消化，使用不含胎牛血清的DMEM培养基重悬计数。Transwell小室的上室中加入基质胶60 μl，其中基质胶：DMEM培养基=1∶2，37℃条件下聚合成胶；下室中加入含600 μl含10%胎牛血清的DMEM培养基。上室中加入1×105个细胞，37℃ 5%CO2浓度的细胞培养箱中培养24 h，弃去上室培养液，擦去未穿膜细胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色10 min，光学显微镜下随机选取10个视野，计数侵袭细胞数。

1.2.4CCL2-shRNA转染细胞后CCL2、ChPF mRNA和蛋白表达水平 取对数生长期的A172细胞，按1×105/孔接种于6孔板中，常规培养至融合度超过30%时，根据Lipofectamine 3000说明书中的操作方法将CCL2-shRNA、Nc-shRNA转染细胞，分为空白对照组、Nc-shRNA组、CCL2-shRNA组，并收集转染36 h后的细胞，使用RT-PCR和Western印迹检测细胞中CCL2、ChPF mRNA和蛋白表达水平，其中CCL2上游引物序列：5′-CCACTGACCCCGTAACTAA-3′，下游5′-GTTCGTCTTCACCCAAGTCC-3′。

1.3统计学分析 采用SPSS21.0软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1转染后各组ChPF mRNA和蛋白表达情况 ChPF-shRNA转染人脑胶质瘤A172细胞72 h后，荧光显微镜下观察可见多数细胞中存在绿色荧光，与背景反差强烈，荧光着色细胞轮廓明显，说明ChPF-shRNA转染效率高；见图1。ChPF-shRNA组ChPF mRNA和蛋白相对表达量明显低于空白对照组和Nc-shRNA组(P<0.01)；ChPF mRNA和蛋白相对表达量在空白对照组与Nc-shRNA组中差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图2。

图1 ChPF-shRNA转染人脑胶质瘤A172细胞72 h(×400)

表1 各组ChPF mRNA和蛋白表达比较

图2 Western印迹检测ChPF蛋白表达

2.2各组细胞增殖能力比较 与空白对照组、Nc-shRNA组相比，ChPF-shRNA组细胞增殖能力明显减弱，48 h、72 h、96 h时，差异有统计学意义(P<0.05)；空白对照组与Nc-shRNA组细胞增殖能力之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3各组细胞周期及凋亡率比较 ChPF-shRNA组S期、G2/M期的细胞比例明显低于空白对照组、Nc-shRNA组，G0/G1期的细胞比例明显高于空白对照组、Nc-shRNA组，差异有统计学意义(P<0.05)；空白对照组与Nc-shRNA组各细胞周期的细胞比例之间差异无统计学意义(P>0.05)。ChPF-shRNA组细胞凋亡率明显高于空白对照组、Nc-shRNA组，差异有统计学意义(P<0.01)；空白对照组与Nc-shRNA组细胞凋亡率之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2 各组培养不同时间细胞增殖能力比较(OD值，

表3 各组人脑胶质瘤A172细胞周期及凋亡率比较

2.4各组细胞侵袭能力比较 空白对照组、Nc-shRNA组、ChPF-shRNA组穿过小室膜的细胞数分别为(35.61±5.08)个、(34.38±4.62)个、(15.97±2.69)个。ChPF-shRNA组穿过小室膜的细胞数明显少于空白对照组、Nc-shRNA组，差异有统计学意义(P<0.01)；空白对照组与Nc-shRNA组穿过小室膜的细胞数差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 Transwell小室检测各组人脑胶质瘤A172细胞侵袭能力(×200)

2.5各组CCL2 mRNA和蛋白表达情况比较 ChPF-shRNA组人脑胶质瘤A172细胞CCL2 mRNA和蛋白相对表达量明显低于空白对照组与Nc-shRNA组，差异有统计学意义(P<0.01)；空白对照组与Nc-shRNA组CCL2 mRNA和蛋白相对表达量之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表4、图4。

2.6转染CCL2-shRNA后对人脑胶质瘤A172细胞中ChPF mRNA和蛋白表达 CCL2-shRNA组CCL2 mRNA和蛋白相对表达量明显低于空白对照组与Nc-shRNA组，差异有统计学意义(P<0.01)；空白对照组与Nc-shRNA组CCL2 mRNA和蛋白相对表达量之间差异无统计学意义(P>0.05)。ChPF mRNA和蛋白相对表达量在各组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表5、图5。

表4 各组CCL2 mRNA和蛋白表达比较

图4 Western印迹检测CCL2蛋白表达

表5 各组人脑胶质瘤A172细胞CCL2及 ChPF mRNA和蛋白表达比较

图5 Western印迹检测人脑胶质瘤A172细胞中CCL2及ChPF mRNA和蛋白表达

3 讨 论

脑胶质瘤恶性程度高、治疗预后差，且发病机制目前仍未完全明确，但基因水平的变异被公认为胶质瘤发生的根本原因之一，胶质瘤基因水平治疗也受到了广泛关注〔10〕。ChPF是人软骨素合成酶生成硫酸软骨素的必要辅助因子，硫酸软骨素广泛分布于人体多个组织中，与脑神经发育、感染、炎症反应密切相关〔11〕，同时还能够抑制脊髓受损后神经轴突的再生〔12〕。提示ChPF可能通过调节人体细胞的分化，介导相关疾病的发生与发展。相关研究显示，结直肠癌组织中存在ChPF高表达，且ChPF表达水平与肿瘤分级呈正相关〔13〕；进一步研究发现，ChPF能够介导结直肠癌组织中软骨素合成，在结肠癌中主要发挥促癌因子作用〔14〕。研究发现，脑胶质瘤组织中ChPF表达水平明显高于正常脑组织〔15〕，提示脑胶质瘤组织中存在ChPF高表达。在此基础上，本研究使用ChPF-shRNA转染人脑胶质瘤A172细胞，经ChPF mRNA和蛋白检测显示细胞中ChPF表达被明显抑制，提示转染成功。CCK-8检测显示，ChPF表达下调后细胞增殖能力被明显抑制；进一步分析细胞周期及凋亡情况显示，ChPF表达下调后G0/G1期细胞数量明显提升，提示细胞增殖受限，且细胞凋亡比例明显增加。Transwell小室实验显示，抑制ChPF表达能够有效降低人脑胶质瘤A172细胞的侵袭能力。上述研究结果表明，ChPF表达下调后，人脑胶质瘤A172细胞的增殖、侵袭能力被抑制，凋亡水平提升。

研究者利用基因芯片技术研究分析发现，敲除ChPF基因表达后糖皮质激素信号通路受到明显影响，其中对CCL2的影响最为显著〔16〕。近年来研究发现，糖皮质激素受体能够通过调控炎症反应，介导肿瘤的发生、发展〔17〕。如乳腺癌患者体内糖皮质激素受体信号能够激活核转录因子(NK)-κB，促进肿瘤细胞的增殖与转移〔18〕。CCL2属于促炎症因子，能够促进肿瘤细胞聚集相关巨噬细胞，作为趋化因子促进肿瘤发生与发展〔19〕。研究证实，炎性微环境能够促进肿瘤细胞的增殖与转化，已被用于抑制肿瘤细胞生长的治疗性实验〔20，21〕。本研究显示，抑制ChPF表达后，人脑胶质瘤A172细胞中CCL2 mRNA和蛋白相对表达量明显下降；但抑制CCL2表达后，ChPF mRNA和蛋白表达水平未出现明显改变；提示ChPF对CCL2表达具有单向调控作用，ChPF可能通过调控CCL2表达来影响人脑胶质瘤细胞活性。