丁念 郑承红
(1湖北中医药大学,湖北 武汉 430065;2武汉市中医医院)
慢性阻塞性肺疾病(COPD)表现为气流受限呈渐进性不可逆的肺部疾病。COPD不但发病率逐渐增高,且已成为人类继肿瘤、心脑血管之后的第四大死因。研究表明COPD常合并全身各系统疾病,其中包括心肌病、骨质疏松(OP)等〔1〕。COPD好发于老年男性患者,其骨密度(BMD)较同龄健康者显著下降,OP发病率可达20%~58%,甚至更高〔2〕。OP是一种代谢性骨病,以单位体积内骨量减少为特点,其病理表现为骨皮质菲薄,骨小梁萎缩稀疏。临床上易发生骨折,患者常受到骨骼疼痛的困扰,是老年患者伤残和死亡的主要原因之一。
老年COPD患者OP的发病率是同龄组非COPD患者的2~5倍〔3〕。同样,OP患者常因肌肉含量下降,骨骼疼痛而直接影响COPD患者的活动耐量及生活质量。本实验拟采用熏香烟联合气道内滴注脂多糖法制备COPD大鼠动物模型〔4〕;利用切除Wistar大鼠双侧睾丸建立OP模型〔5〕;两种造模叠加建立COPD合并OP模型,为临床和实验提供研究基础。
1.1实验动物 雄性Wistar大鼠40只,体重(220±25)g,3月龄,购于湖北省实验动物中心。
1.2试剂和器材 红梅香烟〔红塔烟草(集团)有限责任公司;烟气烟碱量:0.8 mg、焦油量:10 mg、烟气一氧化碳量:12 mg〕;脂多糖(LPS,美国Sigma公司);双能X线吸收BMD测定仪及附带的小动物BMD测定软件(美国Hologic公司);肺功能检测仪AniRes 2005(北京贝兰博科技有限公司);烟熏笼(自制)。
1.3动物分组和模型制备 将40只大鼠分成4组,即正常组、COPD组、OP组和COPD+OP组,每组各10只,适应性喂养1 w后开始实验。正常组大鼠正常喂养不做处理。
1.3.1COPD模型的制备〔4〕COPD组大鼠于自制熏烟箱中,每次以20支香烟烟熏1 h,2次/d,连续12 w,并于造模开始后第7、14、21天给予大鼠气管内注入LPS,仰卧位固定于固定板,暴露声门以拔除针芯的16号静脉套管针插入气管,将LPS(1 mg/kg)通过气管注入,然后使其直立旋转,使LPS分布于两肺。
1.3.2OP模型的制备〔5〕以水合氯醛麻醉后的大鼠俯卧姿势固定,在双侧睾丸位置消毒后,纵向切开后摘除睾丸,滴入2~3滴青霉素,最后将切口缝合。
1.3.3建立COPD+OP模型 采用熏香烟联合气道内滴注LPS法叠加切除双侧睾丸去势法建立大鼠COPD合并OP模型。
1.4标本的制作及指标检测 造模12 w后,予10%水合氯醛2 ml/100 g麻醉大鼠,将大鼠左侧股骨中段置于双能X线吸收BMD测定仪测定BMD值。BMD是判定OP是否建立的金标准,也是检测BMD改变的重要手段。检测完BMD后,用肺功能检测仪AniRes 2005对各组大鼠进行肺功能检测,导出用力肺活量(FVC)、第0.2秒用力呼气容积(FEV0.2)、第0.2秒用力呼气容积与用力肺活量的比值(FEV0.2/FVC)、最大通气量(MVV)。检测完成后,所有大鼠打开胸腔,取下右肺中叶并注射5 ml的4%多聚甲醛,然后再固定在4%多聚甲醛中,用于病理检测。
1.5统计学方法 采用SPSS19.0软件行t检验。
2.1大鼠肺组织病理改变 正常组和OP组支气管黏膜上皮细胞正常,未见淋巴细胞、单核细胞等炎性细胞浸润,肺泡及肺泡壁结构正常。COPD组:支气管黏膜可见鳞状上皮化生,上皮细胞坏死,肺间质及终末细支气管有大量的炎性细胞浸润,肺泡结构破坏,部分融合成肺大泡。COPD+OP组:病理改变同COPD组肺泡结构破坏,且管壁及周围有炎性细胞浸润更多,肺泡部分融合成肺大疱。见图1。
图1 各组肺组织病理切片(HE,×200)
2.2各组肺功能的变化 与正常组比较,COPD组肺功能值显著降低(P<0.05),说明COPD大鼠模型复制成功;与正常组比较,OP组大鼠肺功能值略有降低,但差异无统计学意义(P>0.05);与正常组比较,COPD+OP组肺功能值显著降低(P<0.05);与COPD组比较,COPD+OP组肺功能值略有降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
2.3各组BMD的变化 与正常组比较,OP组BMD值显著降低(P<0.05),说明OP动物模型复制成功;与正常组比较,COPD组BMD值略有降低,但差异无统计学意义(P>0.05);与正常组比较,COPD+OP组BMD值显著降低(P<0.05);与OP组比较,COPD+OP组BMD值略有降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
表1 各组肺功能及股骨BMD测定
研究发现老年男性COPD患者36%~60%同时合并OP,随着肺功能损害程度的增加,其OP严重程度也随之增加〔6〕。老年COPD患者长期吸烟、反复使用糖皮质激素抗炎治疗,久而久之导致OP,出现骨痛骨折,继而活动减少,甚至卧床,又会导致肺部感染,使COPD病情恶化,呼吸困难,再次加大剂量使用糖皮质激素等药物治疗导致恶性循环。而合并OP的患者常因肌肉含量下降,骨骼疼痛直接影响COPD患者的活动耐量及生活质量,临床急需阻断此种恶性循环。建立COPD合并OP大鼠模型,能够进一步临床及实验提供基础。
吸烟已被公认是COPD的最主要的病因,香烟烟雾中的水溶性成分可起支气管平滑肌的高反应性,引发气道病变,导致COPD的发生发展。既往常采用熏香烟的方法建立COPD模型。近年来,国内外采用熏香烟联合气道内滴注LPS法制备COPD模型,更准确地反映出COPD的病理过程。宋小莲等〔7〕发现采用烟熏加气道内注入LPS建立大鼠COPD模型的病理生理改变较之单纯烟熏法与人类COPD的发病特征更为相似。
目前国内外采用肺组织病理学观察和肺功能测定作为评价COPD大鼠模型的主要指标〔8〕。研究发现,COPD模型大鼠的肺组织与人类COPD的病理变化基本一致〔9〕。本研究发现COPD合并OP组大鼠支气管黏膜可见鳞状上皮化生,上皮细胞坏死脱落,小气道上皮锯齿状增生增厚,肺间质及终末细支气管有大量的炎性细胞浸润,肺泡结构破坏,部分融合成肺大泡,肺气肿更明显。
肺功能是判断气流受限,诊断COPD的金标准,对COPD分级、评估、转归、预后都有着重要意义。目前判断大鼠肺功能的指标通常选取Fev0.2、Fev0.2/FVC(%)、MVV等〔10〕。本研究中COPD大鼠模型复制成功。
采用睾丸切除法建立OP大鼠模型可以较好地模拟雄激素缺乏或低下时诱发男性OP的发病过程。国外研究发现切除双侧睾丸8 w后大鼠可表现出OP〔11〕。OP组双侧睾丸切除术是通过模拟男性雄激素缺乏,促进骨吸收抑制骨形成,同时使降钙素分泌减少,破骨细胞活性增加而导致骨质疏松〔12,13〕。BMD检测是诊断OP的核心指标,本研究结果提示动物模型复制成功。
综上,通过检测造模组大鼠肺组织病理及肺功能、BMD的改变验证了采用Wistar雄性大鼠熏香烟方法联合睾丸切除诱导COPD合并OP大鼠模型的方法成功有效。研究表明两种造模方法对大鼠肺功能及BMD存在进一步损伤的影响,与临床相符。本研究建立的COPD合并OP大鼠模型,将为进一步防治COPD合并OP的研究提供动物模型。