慢性阻塞性肺疾病合并骨质疏松大鼠模型建立与评价

丁念 郑承红

(1湖北中医药大学，湖北 武汉 430065；2武汉市中医医院)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)表现为气流受限呈渐进性不可逆的肺部疾病。COPD不但发病率逐渐增高，且已成为人类继肿瘤、心脑血管之后的第四大死因。研究表明COPD常合并全身各系统疾病，其中包括心肌病、骨质疏松(OP)等〔1〕。COPD好发于老年男性患者，其骨密度(BMD)较同龄健康者显著下降，OP发病率可达20%～58%，甚至更高〔2〕。OP是一种代谢性骨病，以单位体积内骨量减少为特点，其病理表现为骨皮质菲薄，骨小梁萎缩稀疏。临床上易发生骨折，患者常受到骨骼疼痛的困扰，是老年患者伤残和死亡的主要原因之一。

老年COPD患者OP的发病率是同龄组非COPD患者的2～5倍〔3〕。同样，OP患者常因肌肉含量下降，骨骼疼痛而直接影响COPD患者的活动耐量及生活质量。本实验拟采用熏香烟联合气道内滴注脂多糖法制备COPD大鼠动物模型〔4〕；利用切除Wistar大鼠双侧睾丸建立OP模型〔5〕；两种造模叠加建立COPD合并OP模型，为临床和实验提供研究基础。

1 材料与方法

1.1实验动物 雄性Wistar大鼠40只，体重(220±25)g，3月龄，购于湖北省实验动物中心。

1.2试剂和器材 红梅香烟〔红塔烟草(集团)有限责任公司；烟气烟碱量：0.8 mg、焦油量：10 mg、烟气一氧化碳量：12 mg〕；脂多糖(LPS，美国Sigma公司)；双能X线吸收BMD测定仪及附带的小动物BMD测定软件(美国Hologic公司)；肺功能检测仪AniRes 2005(北京贝兰博科技有限公司)；烟熏笼(自制)。

1.3动物分组和模型制备 将40只大鼠分成4组，即正常组、COPD组、OP组和COPD+OP组，每组各10只，适应性喂养1 w后开始实验。正常组大鼠正常喂养不做处理。

1.3.1COPD模型的制备〔4〕COPD组大鼠于自制熏烟箱中，每次以20支香烟烟熏1 h，2次/d，连续12 w，并于造模开始后第7、14、21天给予大鼠气管内注入LPS，仰卧位固定于固定板，暴露声门以拔除针芯的16号静脉套管针插入气管，将LPS(1 mg/kg)通过气管注入，然后使其直立旋转，使LPS分布于两肺。

1.3.2OP模型的制备〔5〕以水合氯醛麻醉后的大鼠俯卧姿势固定，在双侧睾丸位置消毒后，纵向切开后摘除睾丸，滴入2～3滴青霉素，最后将切口缝合。

1.3.3建立COPD+OP模型 采用熏香烟联合气道内滴注LPS法叠加切除双侧睾丸去势法建立大鼠COPD合并OP模型。

1.4标本的制作及指标检测 造模12 w后，予10%水合氯醛2 ml/100 g麻醉大鼠，将大鼠左侧股骨中段置于双能X线吸收BMD测定仪测定BMD值。BMD是判定OP是否建立的金标准，也是检测BMD改变的重要手段。检测完BMD后，用肺功能检测仪AniRes 2005对各组大鼠进行肺功能检测，导出用力肺活量(FVC)、第0.2秒用力呼气容积(FEV0.2)、第0.2秒用力呼气容积与用力肺活量的比值(FEV0.2/FVC)、最大通气量(MVV)。检测完成后，所有大鼠打开胸腔，取下右肺中叶并注射5 ml的4%多聚甲醛，然后再固定在4%多聚甲醛中，用于病理检测。

1.5统计学方法 采用SPSS19.0软件行t检验。

2 结 果

2.1大鼠肺组织病理改变 正常组和OP组支气管黏膜上皮细胞正常，未见淋巴细胞、单核细胞等炎性细胞浸润，肺泡及肺泡壁结构正常。COPD组：支气管黏膜可见鳞状上皮化生，上皮细胞坏死，肺间质及终末细支气管有大量的炎性细胞浸润，肺泡结构破坏，部分融合成肺大泡。COPD+OP组：病理改变同COPD组肺泡结构破坏，且管壁及周围有炎性细胞浸润更多，肺泡部分融合成肺大疱。见图1。

图1 各组肺组织病理切片(HE，×200)

2.2各组肺功能的变化 与正常组比较，COPD组肺功能值显著降低(P<0.05)，说明COPD大鼠模型复制成功；与正常组比较，OP组大鼠肺功能值略有降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；与正常组比较，COPD+OP组肺功能值显著降低(P<0.05)；与COPD组比较，COPD+OP组肺功能值略有降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3各组BMD的变化 与正常组比较，OP组BMD值显著降低(P<0.05)，说明OP动物模型复制成功；与正常组比较，COPD组BMD值略有降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；与正常组比较，COPD+OP组BMD值显著降低(P<0.05)；与OP组比较，COPD+OP组BMD值略有降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组肺功能及股骨BMD测定

3 讨 论

研究发现老年男性COPD患者36%～60%同时合并OP，随着肺功能损害程度的增加，其OP严重程度也随之增加〔6〕。老年COPD患者长期吸烟、反复使用糖皮质激素抗炎治疗，久而久之导致OP，出现骨痛骨折，继而活动减少，甚至卧床，又会导致肺部感染，使COPD病情恶化，呼吸困难，再次加大剂量使用糖皮质激素等药物治疗导致恶性循环。而合并OP的患者常因肌肉含量下降，骨骼疼痛直接影响COPD患者的活动耐量及生活质量，临床急需阻断此种恶性循环。建立COPD合并OP大鼠模型，能够进一步临床及实验提供基础。

吸烟已被公认是COPD的最主要的病因，香烟烟雾中的水溶性成分可起支气管平滑肌的高反应性，引发气道病变，导致COPD的发生发展。既往常采用熏香烟的方法建立COPD模型。近年来，国内外采用熏香烟联合气道内滴注LPS法制备COPD模型，更准确地反映出COPD的病理过程。宋小莲等〔7〕发现采用烟熏加气道内注入LPS建立大鼠COPD模型的病理生理改变较之单纯烟熏法与人类COPD的发病特征更为相似。

目前国内外采用肺组织病理学观察和肺功能测定作为评价COPD大鼠模型的主要指标〔8〕。研究发现，COPD模型大鼠的肺组织与人类COPD的病理变化基本一致〔9〕。本研究发现COPD合并OP组大鼠支气管黏膜可见鳞状上皮化生，上皮细胞坏死脱落，小气道上皮锯齿状增生增厚，肺间质及终末细支气管有大量的炎性细胞浸润，肺泡结构破坏，部分融合成肺大泡，肺气肿更明显。

肺功能是判断气流受限，诊断COPD的金标准，对COPD分级、评估、转归、预后都有着重要意义。目前判断大鼠肺功能的指标通常选取Fev0.2、Fev0.2/FVC(%)、MVV等〔10〕。本研究中COPD大鼠模型复制成功。

采用睾丸切除法建立OP大鼠模型可以较好地模拟雄激素缺乏或低下时诱发男性OP的发病过程。国外研究发现切除双侧睾丸8 w后大鼠可表现出OP〔11〕。OP组双侧睾丸切除术是通过模拟男性雄激素缺乏，促进骨吸收抑制骨形成，同时使降钙素分泌减少，破骨细胞活性增加而导致骨质疏松〔12，13〕。BMD检测是诊断OP的核心指标，本研究结果提示动物模型复制成功。

综上，通过检测造模组大鼠肺组织病理及肺功能、BMD的改变验证了采用Wistar雄性大鼠熏香烟方法联合睾丸切除诱导COPD合并OP大鼠模型的方法成功有效。研究表明两种造模方法对大鼠肺功能及BMD存在进一步损伤的影响，与临床相符。本研究建立的COPD合并OP大鼠模型，将为进一步防治COPD合并OP的研究提供动物模型。