熟地黄多糖对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡及炎性因子的影响及其机制

张明焕 毛文 刘雷 祁福 李北 郑一舟

(武汉市第三医院骨科，湖北 武汉 430000)

骨关节炎(OA)是一种常见的关节退行性疾病，其主要病理特征为关节软骨细胞凋亡和细胞外基质的进行性降解〔1〕。近年来研究发现，中药在OA的临床治疗中治疗效果更佳，中药复方剂对阻断或延缓软骨细胞凋亡有一定作用〔2,3〕。熟地黄多糖(RGP)是中药熟地黄的主要成分，具有增强免疫、抗氧化、抗突变等作用〔4〕。此外，熟地黄在治疗类风湿关节炎的方剂中发挥辅助作用，且含熟地黄的中药配方对膝骨关节炎有良好的疗效〔5,6〕。熟地黄多糖还能有效诱导H22荷瘤小鼠肿瘤细胞发生凋亡〔7〕。微小RNA(miRNA)是一类单链非编码的小分子RNA，与OA软骨基质降解过程中的炎性介质及各种细胞因子密切相关〔8〕。研究发现miR-140在OA组织中表达显著减少，且参与软骨细胞的重塑修复过程，与OA的发生发展密切相关〔9〕。但熟地黄多糖对OA软骨细胞增殖、凋亡及炎性因子的影响及熟地黄多糖影响OA的机制是否与miR-140相关还尚未清楚，本实验旨在研究熟地黄多糖对OA软骨细胞增殖、凋亡及炎性因子的影响及其作用机制，为OA临床诊断和治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 胎牛血清、DEME培养基均购自美国Gibco公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和qRT-PCR试剂盒购自日本Takara公司；LipofectamineTM 2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、CCK-8试剂盒、蛋白提取试剂盒、BCA试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙锭(PI)试剂盒购自碧云天生物技术研究所；抗体购自上海煊翎生物科技有限公司。

1.2人OA软骨细胞的分离培养 OA软骨组织由当地骨科医院提供，无菌条件下切碎OA软骨组织，用0.15%的胶原酶充分消化，加入含10%胎牛血清的DEME的培养基终止反应，用22目细胞筛选过滤除渣后再以1 000 r/min的转速离心5 min，去上清。加入无血清的DEME培养液重悬，37℃培养，2～3 d换代一次。

1.3熟地黄多糖的制备 称取适量熟地黄，加6倍量水煎煮1 h；残渣再煎煮2次，每次加3倍量水煮1 h，合并3次煎液，过滤后浓缩至每1 ml含原生药0.2 g，-20℃保存，使用时按所需浓度稀释。

1.4细胞分组和转染 取常规培养的OA软骨细胞消化后接种于96孔板中，培养到细胞贴壁后换成终浓度分别为0.0 μg/ml、12.5 μg/ml、25.0 μg/ml、50.0 μg/ml的熟地黄多糖再培养48 h，分别记为RGP 0.0 μg/ml组、RGP 12.5 μg/ml组、RGP 25.0 μg/ml组、RGP 50.0 μg/ml组；以不添熟地黄多糖培养的细胞作为对照(Control)组，以50.0 μg/ml熟地黄多糖培养的细胞为RGP组。OA软骨细胞用无血清培养基培养12 h后进行转染，将anti-miR-con、anti-miR-140质粒转染至OA软骨细胞中，再用50 μg/ml的熟地黄多糖处理后记为RGP+anti-miR-con组和RGP+anti-miR-140组；转染按照LipofectamineTM 2000试剂盒进行操作。

1.5qRT-PCR分析miR-140的表达水平 按照Trizol说明书提取总RNA，用反转录试剂盒逆转录成cDNA，按照TaKaRa 荧光定量试剂盒使用说明配制反应体系，以β-actin为内参进行PCR扩增，每个样品重复3次，循环条件为95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环；60℃延长5 min。相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.6CCK-8法测定细胞增殖 分别在各组细胞培养至48 h时，每孔加入10 μl CCK-8试剂继续孵育2 h。酶标仪测定各孔490 nm波长处吸光度A值，每组3个复孔取平均值。

1.7流式细胞术检测细胞凋亡 用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化各组细胞，离心收集各组细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2次，加结合缓冲液重悬细胞。依据试剂盒说明书，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式细胞仪检测激发波长488 nm和发射波长530 nm处的荧光强度。实验重复3次。

1.8ELISA检测白细胞介素(IL)-1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达水平 取各组细胞，离心取上清，按ELISA试剂盒说明书进行检测。

1.9统计学分析 采用SPSS20.00软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1熟地黄多糖对OA软骨细胞增殖的影响 相较于RGP 0.0 μg/ml组，RGP 25.0 μg/ml组和RGP 50.0 μg/ml组OA软骨细胞的吸光度值显著升高(0.64±0.05、0.94±0.05、1.18±0.07；P<0.05)，RGP 12.5 μg/ml组吸光度值(0.78±0.06)无显著变化。可见，一定浓度的熟地黄多糖可促进OA软骨细胞增殖。选用浓度为50 μg/ml的熟地黄多糖做后续实验。

2.2熟地黄多糖对OA软骨细胞凋亡的影响 与对照组相比，RGP组OA软骨细胞的凋亡率显著降低〔(7.51±0.82)%vs (3.50±0.36)%；P<0.05〕。见图1。

2.3熟地黄多糖对OA软骨细胞炎性因子表达的影响 与对照组相比，RGP组OA软骨细胞中IL-1β和TNF-α的表达水平显著降低(P<0.05)。见图2、表1。

2.4熟地黄多糖对OA软骨细胞miR-140表达的影响 与对照组相比，RGP组OA软骨细胞中miR-140表达水平显著升高(P<0.05)。见表1。

图1 熟地黄多糖对OA软骨细胞凋亡的影响

图2 熟地黄多糖对OA软骨细胞炎性因子表达的影响

表1 熟地黄多糖对OA软骨细胞炎性因子表达及miR-140表达的影响

2.5熟地黄多糖通过上调miR-140的表达促进OA软骨细胞的增殖并抑制其凋亡 与RGP+anti-miR-con组相比，RGP+anti-miR-140组OA软骨细胞中miR-140表达水平、吸光度值显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 抑制miR-140的表达逆转了熟地黄多糖对OA软骨细胞增殖的促进作用和凋亡的抑制作用

2.6熟地黄多糖通过上调miR-140的表达抑制OA软骨细胞炎性因子的表达 与RGP+anti-miR-con组相比，RGP+anti-miR-140组OA软骨细胞中IL-1β和TNF-α表达水平显著升高(P<0.05)。见图3、表3。

1～4：Control组、RGP组、RGP+anti-miR-con组、RGP+anti-140组图3 Western印迹检测OA细胞炎性因子的表达

表3 抑制miR-140的表达逆转熟地黄多糖对骨关节炎软骨细胞炎性因子表达的抑制作用

3 讨 论

在OA的病理进程中，炎症可促进形成滑膜炎及破坏软骨，而软骨细胞的异常凋亡对OA的发生发展至关重要〔10,11〕。中医药治疗OA疗效明确，可以改善滑膜炎症、降低炎症因子水平、抑制氧自由基损伤、抑制软骨细胞凋亡等〔12〕。熟地黄多糖是中药熟地黄的一种提取物，据报道熟地黄多糖对阿霉素所致的白细胞减少导致的免疫功能损伤有一定的预防和保护作用〔13〕；熟地黄多糖还可通过TNF-α、信号转导及转录活化因子(STAT)3和酪氨酸激酶(JAK)的表达抑制鼻咽癌增殖转移，且具有一定的时间和剂量依赖性〔14〕。熟地黄具有免疫增强作用，增强T淋巴细胞Th1和Th2细胞因子的表达〔15〕。本实验研究结果表明熟地黄多糖可以促进OA软骨细胞增殖，抑制凋亡。即熟地黄多糖可有效治疗OA。

研究显示miRNA可通过调控软骨组织的降解、软骨细胞凋亡从而参与OA的发生发展〔16〕。miR-140在OA软骨中显著下调，在软骨细胞增殖分化和关节炎的发病机制中起重要作用〔17〕。miR-140参与调控人类软骨形成和发育，并促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，IL-1β是软骨退化和关节反应中的重要介质，用IL-1β刺激软骨细胞可抑制miR-140表达〔18〕。本实验中抑制miR-140表达可促进炎性因子IL-1β的表达。miR-140基因敲除能导致小鼠软骨内成骨的生长缺陷〔19〕；miR-140可能通过胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)-5引起软骨细胞合成减少，引起OA样变〔20〕。以上研究结果均显示miR-140对OA的发生发展具有重要的调控作用，本实验研究结果说明抑制miR-140表达可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡；抑制miR-140表达逆转了熟地黄多糖对OA软骨细胞增殖促进、凋亡抑制作用，此外，熟地黄多糖可上调miR-140的表达。说明熟地黄多糖可能通过调控miR-140影响OA软骨细胞的增殖和凋亡。

OA软骨中IL-1β和TNF-α mRNA表达上调〔21〕；IL-1β可诱导OA软骨细胞的炎症反应，TNF-α可刺激OA软骨细胞凋亡，TNF-α还能诱导IL-1β的产生，而IL-1β能提高TNF-α的活性，两者具有协同作用，介导对关节组织的破坏〔22〕。本实验说明抑制miR-140表达促进炎性因子的表达，抑制miR-140表达逆转了熟地黄多糖对IL-1β和TNF-α的抑制作用。

综上所述，熟地黄多糖抑制IL-1β和TNF-α的表达，促进OA软骨细胞的增殖，抑制凋亡，其机制可能与调控miR-140及炎性因子的表达有关；可为OA的治疗提供新的研究思路和理论依据。