硫酸软骨素钠质量安全标准及关键控制点研究进展

赵 琳，姜 雨，兰 韬，吴 琦，张梦妍，尹秀文，刘洪宇,，云振宇,

（1.中国标准化研究院农业食品标准化研究所，北京 100191；2.国家市场监督管理总局食品审评中心，北京 100160）

硫酸软骨素钠是动物软骨组织中提取制得的硫酸化链状糖胺聚糖钠盐，主要由不同位置硫酸化的D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖以1→3 糖苷键连接，二糖单位以1→4 糖苷键连接而成的生物大分子。根据硫酸基位置和数量的不同，硫酸软骨素钠可以细分为A、B、C、D、E 等不同的类型。目前国内外商品化的硫酸软骨素钠多来自猪、鸡、牛、羊、鲨鱼、鱿鱼等动物软骨组织，经软骨降解、核心蛋白水解、去蛋白、回收、纯化等过程制得。

硫酸软骨素钠主要作为一种缓解骨关节炎（osteoarthritis，OA）症状的慢作用药物（symptomatic slow acting drugs for osteoarthritis，SYSADOA），在长期治疗中有缓解疼痛症状、改善关节功能、延缓病程进展的作用。口服硫酸软骨素钠的随机对照临床试验已证实，硫酸软骨素钠能够减轻骨关节炎患者的疼痛，降低炎症标志物水平，改善关节功能、减少关节肿胀和积液，阻止关节间隙狭窄，而且作用温和，不良反应小。美国FDA 认定硫酸软骨素钠为膳食补充剂，主要用于缓解关节不适症状及保护软骨组织。在欧洲、澳大利亚等地区，硫酸软骨素钠被划分为辅助防治骨关节炎药品范畴，在我国，硫酸软骨素钠作为药品、保健食品已有多年的安全使用历史。中国是畜牧业大国，猪、牛、羊等饲养量、屠宰量都居世界首位，凭借资源优势，已是世界上最大的硫酸软骨素钠生产国和出口国。

硫酸软骨素钠作为从动物软骨组织中提取的天然酸性黏多糖，其结构、物理化学特征、生理活性会因动物种类、组织、提取工艺的不同而存在差异。商品化的硫酸软骨素钠又因其纯度等级差异、污染物的存在、生物效应有限等问题，使得硫酸软骨素钠的质量控制显得格外重要。本文通过对比中国、美国、日本、欧洲等国家区域药典收载的硫酸软骨素钠原料标准，分析现阶段硫酸软骨素钠质量安全标准化发展现状，进而提炼影响硫酸软骨素钠质量安全的关键控制点并进行深入分析与探讨，以期为硫酸软骨素钠质量安全控制体系的完善提供参考。

1 各国药典标准比较

药典作为各国家药品生产、供应、使用和管理的法定技术依据，对保证药品质量和安全具有十分重要的作用。从动物软骨中提取制备的硫酸软骨素钠原料已被美国（USP43）、欧洲（EP.10.0）、日本（日本药局方外医药品规格）、中国（《中国药典2020 版》）等国家最新版本的药典收录，其标准的比较见表1。

表1 不同国家药典收录硫酸软骨素钠标准的比对Table 1 Comparison of chondroitin sulfate sodium standards in different pharmacopoeia

1.1 USP43

USP43 分别对陆地动物来源（牛、猪和禽类）和鲨鱼来源的硫酸软骨素钠做了规定，内容包括定义、鉴别、成分、杂质、污染物、特定测试和附加要求七个部分。USP43 在硫酸软骨素钠的定义中直接规定了硫酸软骨素钠干燥后含量应在90.0%至105.0%。陆地动物来源的硫酸软骨素钠结构上应以4 位硫酸化二糖为主，鲨鱼来源应以6 位硫酸化二糖为主，且含有不少于8%的2,6 位硫酸化二糖。USP43 提供了红外光谱、钠盐反应、二糖组成分析、比旋光度四种鉴别方法，采用氯化十六烷基吡啶（CPC）滴定法测定含量。USP43 在杂质上对炽灼残渣、氯化物、硫酸盐、电泳纯度、蛋白质等5 项指标做了限定。污染物要求细菌总数不超过10CFU/g、霉菌和酵母总数不超过10CFU/g，不得检出沙门氏菌与大肠杆菌。特定测试部分主要规定了非特定二糖限度、溶液澄清度与颜色、比旋度、pH 和干燥失重等。相比陆地动物来源的硫酸软骨素钠，USP43 鲨鱼来源标准的区别主要体现在二糖成分和比旋度限定的差异。

1.2 EP10.0

EP10.0 中规定的硫酸软骨素钠来源为符合人类食用要求的陆地或海洋动物的软骨，含量应在95.0%至105.0%，提供了红外光谱、钠盐反应、电泳三种鉴别方法。EP10.0 在硫酸软骨素钠杂质方面对氯化物、电泳纯度、蛋白质等3 项指标做了限定，EP10.0规定蛋白质含量不高于3.0%，比USP43 规定的不高于6.0%严格。污染物要求细菌总数不超过10CFU/g、霉菌总数不超过10CFU/g，不得检出金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和胆汁耐受革兰氏阴性菌等，相比USP43 略严格。EP10.0 增加了特性粘度的要求，并通过比旋度来区分陆地动物来源和海洋动物来源的硫酸软骨素钠。

1.3 日本药局外方医药品规格

《日本药局外方医药品规格》规定硫酸软骨素钠应为哺乳动物或鱼类的软骨提取制得，经干燥后定量应含氮2.5%～3.8%和硫5.5%～7.0%。标准提供了显色反应、硫酸盐定性、钠盐反应三种鉴别方法，规定了炽灼残渣、氯化物、硫酸盐等3 项杂质限量，未对微生物限量做出规定，重金属含量（以铅计）小于等于20 ppm，砷含量小于等于2 ppm。标准并未给出区分哺乳动物或鱼类来源的硫酸软骨素钠的方法或指标。

1.4 中国药典2020 版

中国药典2020 版收载了硫酸软骨素钠原料和硫酸软骨素钠片、硫酸软骨素钠胶囊两种制剂，规定了硫酸软骨素钠系自猪的喉骨、鼻中骨、气管等软骨组织中提取制得的硫酸化链状黏多糖钠盐，比旋度为-25.0°～-32.0°；提供了液相色谱、红外光谱、钠盐反应三种鉴别方法，并要求对含氮量、pH、氯化物、硫酸盐、残留溶剂、干燥失重、炽灼残渣、重金属等项目进行检查；硫酸软骨素钠含量测定方法为高效液相色谱法（通则0512），应为90.0%～105.0%。

1.5 对比分析

对比中国药典2020 版、USP43、EP10.0、日本药局外方医药品规格，EP10.0 和日本药局外方医药品规格中规定的硫酸软骨素钠的来源均为多种动物，即陆地或海洋来源的动物的软骨。USP43 将鲨鱼软骨来源的硫酸软骨素钠做了单独的规定，但与牛、猪或禽类来源的质控项目和限度并无太大区别。我国药典中规定的来源是一种，即猪的喉骨、鼻中骨、气管等软骨组织中提取，与其他国家的质量安全标准相比，具有特殊性。因不同来源的硫酸软骨素钠的二糖单元所占比例、电荷密度、4S/6S 比值和相对分子量不同，故我国药典中规定质控项目和限度与其他国家药典存在一定差异。由于USP43 和EP10.0 规定的硫酸软骨素钠来源多样，针对硫酸软骨素钠的含量测定均采用了CPC 滴定法。该方法影响因素少，便于操作，但专属性较差。中国药典2020 版只规定了猪来源，采用的是酶解-高效液相色谱法测定硫酸软骨素钠的含量。日本的标准仅规定了硫酸软骨素钠的含氮量与含硫量。除了规定常规的杂质限量外，USP43 和EP10.0 需电泳法测定硫酸软骨素钠的纯度，要求任何单个杂质不得超过2%。中国药典2020版与日本标准则是通过含氮量来进一步反映产品纯度。虽然硫酸软骨素钠含氮，但比一般蛋白质的平均氮含量要低得多，因此氮含量也是控制硫酸软骨素钠纯度的一个重要指标。中国药典2020 版与日本标准规定了重金属含量，未限定微生物，而USP43 和EP10.0 对微生物进行了限定，未对重金属做要求。中国药典需要在硫酸软骨素钠来源广泛性和安全指标上进行完善改进。

目前，我国的硫酸软骨素钠标准体系中，除了中国药典收载的口服用硫酸软骨素钠、硫酸软骨素钠片和硫酸软骨素钠胶囊，国家药品标准第九册收载了硫酸软骨素滴眼液和硫酸软骨素钠注射液，规范了性状、鉴别、检查、含量测定等基本要素，指标要求均低于中国药典2020 版收载的口服用硫酸软骨素钠标准。我国还有1 项硫酸软骨素钠的含量测定方法国家标准和1 项硫酸软骨素用原料的农业行业标准。国家标准《硫酸软骨素和盐酸氨基葡萄糖含量的测定 液相色谱法（GB/T 20365-2006）》规定了液相色谱法测定从牛、猪和鲨鱼等动物软骨组织中提取的硫酸软骨素钠和盐酸氨基葡萄糖含量的方法。农业行业标准《硫酸软骨素用原料（NY/T 3906-2021）》对提取硫酸软骨素的畜禽骨原料进行了规范。

此外，通过调查研究发现，我国保健食品领域实际使用的硫酸软骨素钠原料来源多样，多数无法按照中国药典的标准来开展质量控制，大多数原料生产商使用自身的企业标准。鉴于保健食品与药品的差异，制定保健食品用的硫酸软骨素钠原料标准已经变得十分重要且紧迫。

2 质量安全关键控制点

2.1 来源

不同来源的硫酸软骨素钠均由一个碳水化合物主链，不同百分比和位置的硫酸基双糖组成，生成具有不同电荷密度的聚合物（图1）。此外，不同聚合等级的硫酸软骨素钠可能产生不同的分子质量和多分散性，这与特定的组织、器官和物种有关。正是由于这些结构差异，不同来源的硫酸软骨素钠可能具有不同的生物学特性和能力。但是，将硫酸软骨素钠生物学特性与结构类型进行对应的相关文献报道仍然很少。

图1 不同类型硫酸软骨素钠化学结构Fig.1 Chemical structure of different types of sodium chondroitin sulfate

目前，硫酸软骨素钠主要来源于陆地动物，如猪、牛和鸡，或海洋动物，如软骨鱼类、鲨鱼和鳐鱼。陆地动物软骨中主要含有硫酸软骨素钠A，而海洋动物的软骨中主要含有硫酸软骨素钠C，通过确定二糖分析和相对分子质量可进行确定。猪、牛和鸡来源的硫酸软骨素钠二糖4S/6S 比值大于1，电荷密度小于1；而鲨鱼等海洋动物来源的硫酸软骨素钠4S/6S 比值小于1，电荷密度大于1。但是在实际的商业生产中，混合来源也是十分常见的，可能生产出具有混合特性和性质、结构不受控制、重现性差以及具体来源无法确定的最终产品。已有报道显示，在治疗期间口服硫酸软骨素钠时，生物利用度和药代动力学的变化取决于硫酸软骨素钠的结构特征和来源，缺乏这些关键信息可能会影响实验数据的解读分析，不利于硫酸软骨素钠一些新的治疗应用的研究发展。因此，建立快速、准确的硫酸软骨素钠物种来源鉴别方法，对硫酸软骨素钠来源的严格把控是非常有必要的。针对混合来源的硫酸软骨素钠，则需要有更加严格的限定。

2.2 潜在的外源污染物

动物来源生产的硫酸软骨素钠通常需要长而复杂的提取和纯化过程，其主要目的是消除或减少其他分子的含量，如果控制不好就会造成硫酸软骨素钠的污染。依据现有的科学文献报道，高纯度、高质量的硫酸软骨素钠用于OA 治疗，才具有较好的有效性和安全性。尽管随着净化工艺的发展，已经可以实现生产更高质量的硫酸软骨素钠，但是一些潜在的外源污染物的检测仍然是不能忽视的环节。已知潜在的外源污染物主要包括其他多糖（以糖胺聚糖类为主）、蛋白质、有机小分子、病毒、朊病毒和溶剂等。各国药典和标准文件对其中一些杂质设定了相应的限量要求，但影响纯度的其他多糖、常规手段难以去除的朊病毒需格外关注。

2.2.1 多糖 透明质酸（hyaluronic acid，HA）和硫酸皮肤素（dermatan sulfate，DS）都属于糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）类的天然大分子，由于它们普遍存在于生产硫酸软骨素钠的组织中，在硫酸软骨素钠产品中可被检测到。此外，硫酸角质素（keratan sulfate，KS）以蛋白多糖的形式存在于所有软骨中，与硫酸软骨素钠有相似的物理化学性质，并且具备免疫原性，能够产生免疫反应，已在各种来源的硫酸软骨素钠成品中检测到。例如：有研究显示，在一些批次的商业化硫酸软骨素钠样品中检测到HA 含量高达1.5%，KS 的检出率也在15%～20%左右。采用免疫扩散和酶联免疫吸附试验检测了15 份样品，包括4 份作为实验室试剂的硫酸软骨素钠，1 份作为食品添加剂的硫酸软骨素钠和10 份含有硫酸软骨素钠的膳食补充剂，结果显示除了3 个作为实验室试剂的硫酸软骨素钠样品外，所有样品均含有不同量的硫酸角质素。这些多糖大分子可能导致副作用和过敏反应均有所报道。另一方面，由于这些多糖的性质和化学结构与硫酸软骨素钠非常相似，常规的非特异性分析方法，如十六烷基氯化吡啶（CPC）滴定法和咔唑法可能无法检测到硫酸软骨素钠中其他多糖的存在。因此，针对与硫酸软骨素钠性质和结构相似的多糖，需开发专属性和准确性更好的检测方法。

2.2.2 朊病毒 用于硫酸软骨素钠生产的动物器官和组织中可能携带病原体，如细菌、病毒和朊病毒，可能会给硫酸软骨素钠产品带来安全问题。虽然这类病原污染物可通过特定的化学反应来破坏、灭活和消除，但是有可能导致硫酸软骨素钠发生降解、脱硫、碳水化合物链的氧化、化学基团掺入等结构上的改变。朊病毒是一类能侵染动物无免疫原性的疏水蛋白质，附着在细胞表面，蛋白酶处理、常规化学试剂和高温等处理方式都难以将其去除，朊病毒及其他具有相似属性的病原体已成为动物源医药制品的一个主要问题。目前可用的朊病毒检测分析方法成本高，而且仅限于专门的实验室。因此，需要从动物源头控制，或开发特异性、低成本的分析方法，来检测硫酸软骨素钠终产品中可能存在的不同感染因子。

2.3 掺假

除了存在自然污染外，市场上流通的硫酸软骨素钠还可能被人为的添加更便宜的多糖和有机衍生物，部分多糖和有机衍生物无法用常规的检测分析方法来测定。许多掺假的分子已被鉴定，如卡拉胶、蛋白质和表面活性剂、便宜的多糖、海藻酸钠、藻酸双酯钠、六偏磷酸钠等。掺假的分子可能会干扰硫酸软骨素钠的常规定量分析方法，如CPC 滴定法和咔唑测定法，不能进行有效区分，从而导致测定的硫酸软骨素钠含量被夸大。USP43 和EP10.0 均采用CPC 滴定法测定硫酸软骨素钠含量，采用电泳法进行纯度测定，可能与USP43 和EP10.0 规定的硫酸软骨素钠来源广泛有关。我国2020 版药典中规定使用酶解-高效液相色谱法测定硫酸软骨素钠含量，按外标法以软骨素二糖、6-硫酸化软骨素二糖和4-硫酸化软骨素二糖的峰面积之和计算。近些年的研究已证实，酶解-高效液相色谱、高效凝胶过滤色谱（HPSEC）、电泳等方法用于硫酸软骨素钠的掺假鉴别准确率高。李莹莹等应用太赫兹时域光谱（Terahertz Time-domain Spectroscopy，THz-TDS）技术和红外光谱技术分别测定掺入六偏磷酸钠的鲨鱼硫酸软骨素钠模拟掺假品，对比研究发现，THz-TDS 作为一种准确、快速、无损的新型光谱技术，更适合于鉴别鲨鱼硫酸软骨素钠的六偏磷酸钠掺假。目前鲨鱼来源的硫酸软骨素钠价格昂贵，市场上掺假的情况较多，需要有针对性地优化相应的检测方法。

3 结语

原料、生产工艺、污染物以及许多其他因素都会影响硫酸软骨素钠的结构与活性，进而影响硫酸软骨素钠的生物特性及营养和药理功能，使得硫酸软骨素钠的质量安全控制需要更多的关注和重视。本文通过对中国、美国、日本、欧洲药典收载的硫酸软骨素钠原料标准进行对比分析，发现不同国家或地区执行的标准存在一定的差异。中国药典由于使用单一来源，有其特殊性，但仍需完善其他来源硫酸软骨素钠的质量标准。综合分析各国药典标准与最新的研究成果，发现来源、潜在外源污染物、掺假等是影响硫酸软骨素钠质量安全的关键点，需要进一步开展针对性研究。未来还需要通过建立从动物原材料到成品的可追溯系统、完善的标准体系及检验检测配套设施，不断推动行业整体水平提升。