解淀粉芽孢杆菌中脂肽的生物合成、抑菌机理及应用的研究进展

罗晓娇，孙 静，陆颖健

（南京财经大学食品科学与工程学院，江苏南京 210023）

农作物在生长过程中容易受到多种病原菌的侵害，导致其产品品质和产量下降。化学合成杀菌剂的大量使用，在一定程度上减少了植物病害。随着人们食品安全意识的不断加强，同时在化学合成的杀菌剂、防腐剂和抗生素等的使用受到限制的情况下，亟需寻找和开发新型绿色天然、环境友好型的抗菌物质。抗菌肽因其低耐药性而被认为是抗生素的安全替代品，受到了广泛关注，它包括抗菌素、抗菌蛋白、脂肽以及挥发性抗菌物质等，具有抗真菌、细菌、病毒以及抗癌、抗肿瘤等功能。研究发现抗菌肽不仅可以应用到农作物中，还可在工业、医疗、环境保护等领域发挥作用。脂肽大多由芽孢杆菌次级代谢产生，不同种类的芽孢杆菌可产生具有多种类型广谱抗菌活性的脂肽。解淀粉芽孢杆菌为革兰氏阳性细菌——可产生抗菌脂肽的菌种之一，是需氧或兼性厌氧且有荚膜的杆菌，抗逆性极强且抗菌活性高，可抑制灰葡萄孢、链格孢、尖孢镰刀菌、山茶灰斑病菌、黑曲霉和粉红单端孢等植物病原菌的生长。脂肽是一类由亲水性肽链和亲脂性脂肪烃链组成的两亲性表面活性剂，主要包括表面活性素（Surfactin）、丰原素（Fengycin）以及伊枯草菌素（Iturin）三大类。本文从多方面综述了脂肽的结构类型、生物合成、抗菌机制以及应用等，可为研究者提供脂肽的一些相关信息以及在食品防腐的应用中提供参考。

1 解淀粉芽孢杆菌中抗菌脂肽的类型

解淀粉芽孢杆菌产生的抗菌脂肽主要包括伊枯草菌素（Iturin）、表面活性素（Surfactin）以及丰原素（Fengycin）等三大家族（表1）。一般脂肽类抗生素分子量较低，形态较大，含有特殊的氨基酸，如D-氨基酸；并且都具有高度相似的氨基酸序列，一般由含7～10 个氨基酸的肽链和脂肪酸或羟基脂肪酸组成。尽管它们具有相似的结构，但其物理和化学特性千差万别。图1 呈现了这几种脂肽的结构。

表1 脂肽主要类型Table 1 Main types of lipopeptides

图1 脂肽结构式[6]Fig.1 Structural formula of lipopeptides[6]

Iturin 是中性或单阴离子脂肽，它是由含C～C的-氨基脂肪酸链与7 个强极性氨基酸短肽通过酯键连接而形成的环肽内脂，具有手性序列LDDLLDL，残基数量有限（Asx、Glx、Pro、Ser、Thr、Tyr）。此外，该家族的一个重要特征是各个成员中环七肽的前三个氨基酸相同（-羟基脂肪酸-Asx-Tyr-Asx），而在其他四个位置显示出差异。Iturin 家族主要包括伊枯草菌素A（Iturin A）、伊枯草菌素C（Iturin C）、杆菌霉素D（Bacillomycin D）、杆菌霉素F（Bacillomycin F）、杆菌霉素L（Bacillomycin L）、杆菌肽（Bacillopeptin）和抗霉枯草菌素（Mycosubtilin）等。它们都具有较强的溶血活性，对霉菌、酵母等有较强的抑制作用，而对细菌的抑菌作用较小。

Surfactin 由7 个氨基酸的C 端和含C～C的-羟基脂肪酸连接而成的环形脂肽。该家族主要包括表面活性素（Surfactin）、埃斯波素（Esperin）、盐酸杆菌素（Halobacillin）以及Pumilacidin 等物质，与Iturin 一样，也具有较强的溶血活性，同时具有抗病毒、抗支原体和抗菌等功能。

Fengycin 是由Vanittanakom 等在1986 年鉴定的，由脂十肽组成，肽部分有一个内部内酯环，-羟基脂肪酸链可以是饱和的或不饱和的；通常被分为Fengycin A 和Fengycin B，以及制磷脂菌素A（Plipastatin A）和制磷脂菌素B（Plipastatin B），主要表现出对酵母和丝状真菌的抗菌活性。相较于Iturin 和Surfactin，Fengycin 的溶血活性较弱，但其杀真菌活性更强。

研究发现大多解淀粉芽孢杆菌产生抑菌效果的脂肽物质主要为Surfactin、Fengycin 及Bacillomycin D，其中Bacillomycin D 属于Iturin 家族，Bacillomycin D 对分生孢子有较强的抑制作用，对葡萄孢霉具有抗真菌活性。Qian 等研究Bacillomycin D 在30 μg/mL 的浓度下可抑制赭曲霉菌丝的生长和产孢，浓度为90 μg/mL 时可完全抑制赭曲霉的生长和食品中赭曲霉毒素的产生。另外，Sun 等通过研究Bacillomycin D 对禾谷镰刀菌的抑制效果发现，Bacillomycin D 在75 μg/mL 浓度下不仅可以对禾谷镰刀菌的抑制率达到94.6%，还可以在一定程度上抑制脱氧雪腐镰刀菌烯醇的产量。汪静杰等研究了解淀粉芽孢杆菌SWB16 对球孢白僵菌的拮抗作用，发现其抗菌物质主要为Fengycin 和Iturin等脂肽类的物质。在解淀粉芽孢杆菌SQR9 中也发现了Bacillomycin D 和Fengycin 两种脂肽。Liu 等在研究中发现在Fengycin A 的浓度为128 μg/mL时可最大程度地抑制白色念珠菌的生长。除了脂肽单独使用进行抑菌外，还可使用丁二酸-壳聚糖体体系进行包埋Iturin A，对薯黑斑病菌和匍枝根霉菌的抑制率分别达到75.03%和80.54%。通过这些发现Iturin 家族是解淀粉芽孢杆菌产生抑菌作用不可缺少的物质。

2 解淀粉芽孢杆菌中抗菌脂肽的生物合成

脂肽合成的关键是非核糖体合成酶系统（NRPS），脂肽以NRPS 顺序添加氨基酸残基合成。NRPS 主要由多个模块按特定的空间顺序排列而成，每个模块主要包含三个核心结构域，即腺苷酸结构域（Adenylation domain，A domain）、肽基载体蛋白结构域（The peptidyl carrier domain，PCP domain）和缩合结构域（Condensation domain，C domain），分别对应于底物的识别和活化、向各自催化中心的转运和肽键的形成，这三个结构域形成了执行延伸功能的最小模块，这是NRPS 的基本重复单位。

NRPS 具有实现起始、延伸和终止功能的模块化组织。在整个NRPS 的合成过程中PCP 结构域起着穿梭底物的作用。此外，在NRPS 最后一个模块还有硫酯酶结构域（Thiolipase domain，TE domain），以水解或环化的方式释放合成完整的多肽，以保证NRPS 能持续循环合成新的多肽。在脂肪酸被活化并装载到肽合酶系统上后，肽链的延伸和环化是合成环脂肽的关键步骤，脂肽合成的最后一步是释放产物，然后重新开始下一轮合成，这通常由硫酯酶结构域完成。Iturin、Surfactin 和Fengycin的主要生物合成如图2 所示，关于脂肽生物合成的总结见表2。

图2 脂肽的生物合成Fig.2 Biosynthesis of lipopeptides

表2 脂肽生物合成总结Table 2 Summary of lipopeptide biosynthesis

与Surfactin 和Fengycin 不同，Iturin 衍生物是由含有聚酮化合物的非核糖体多肽合成酶体系（Polyketides-nonribosomal peptide，PKS-NRPS）的杂化复合物合成的，其主要有四个开放阅读框，分别为、、和，编码丙二酰辅酶A 转酰基酶结构域（Malonyl-CoA transacylase，MCTdomain），包含与聚酮合成酶相关基因，这些基因负责脂肪酸链生物合成的最后步骤（最后的延伸和氨基化），然后转移到肽链部分，通过酰基辅酶A 连接酶结构域（Acyl-CoA ligase，AL-domain）、酰基载体蛋白结构域（Acyl carrier protein，ACP-domain）、-酮酰基合成酶结构域（-keto acyl synthetase，KSdomain）以及氨基转移酶结构域（Amino transferase，AMT domain），最后经过NRPS 继续合成并释放。据报道氮源对Iturin 的合成和活性有显著影响，过量的氮源可能会导致Iturin 的合成终止，Sigma A 因子和转录因子ComA 也对Iturin 的合成以及抗菌活性具有调节作用，其过量表达可以增加Iturin 产量。另外Iturin 家族的决定性特征是环七肽的前三个氨基酸在成员之间共享而其余四个是可变的。酪氨酸残基在形成Iturin 的抗生素活性中起着重要作用。解淀粉芽孢杆菌中含有的Iturin 家族中的脂肽主要为Iturin A。基因的过表达可以提高Iturin A的产量。Bacillomycin D 也是Iturin 家族中研究较多的次级代谢产物，在解淀粉芽孢杆菌fmbJ 中，Bacillomycin D 的产量随着生物量的增加而增加，这归因于群体感应蛋白ComA、DegU、SigmaH、Spo0A的上调，导致合成酶基因和硫酯酶的高表达，进而提高了Bacillomycin D 的产量。

Surfactin 是解淀粉芽孢杆菌产生的脂肽类抗菌物质中主要的一类，是目前已知的最重要的生物表面活性剂之一，在工业领域中常被应用于洗涤剂的生产中。对于Surfactin 的生物合成，主要有三个遗传位点分别为、和，编码4-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，为肽合成的一个重要组成部分。是Surfactin 合成的关键基因，该基因包括4 个亚基，即，可以编码三种多功能肽合酶以及一种硫酯酶，其中，和组装前六个氨基酸，和皆为模块化合成酶，每个都包含三个模块，分别催化三种氨基酸的激活和合并；负责激活第七个氨基酸，同时负责编码硫酯酶结构域以终止肽链延伸并释放多肽产物。激活启动子的转录，主要包含、、和四个基因。是调节Surfactin 合成的关键因素，可以与的启动子结合来控制Surfactin 的转录进而来调控的表达；敲除会导致Surfactin 的产量下降，而的表达受、、和的调控，其中的敲除可以使的表达量增加。

Fengycin 是由NRPS 系统合成的，其合成酶操纵子由五个基因组成，分别编码FenA～FenC五个单体酶，FenC 是Fengycin 合成系统中NRPS 的起始模块。每个模块都具有接受特定氨基酸及形成相应肽键的功能。PhoP-PhoR 是芽孢杆菌中一个重要的双组分调节系统。PhoR 是一种组氨酸传感器激酶，它可以磷酸化其同源的反应调节剂PhoP（PhoP～P）。PhoP 的基因突变株合成Fengycin的能力减弱。在对FZB42 的研究中发现，具有非同义核苷酸碱基的PhoR 可以改变PhoP 的磷酸化水平，从而影响Fengycin 的产生。也有些解淀粉芽孢杆菌无法产生Fengycin，如解淀粉芽孢杆菌DSM7。

3 脂肽的抗菌机制

脂肽是一种具有独特两亲性的微生物次级代谢产物，一部分是由多个氨基酸组成的肽链为亲水基，另一部分为具有-羟基或氨基的脂肪酸链，为亲油基。由于其独特的两亲性结构和化学组成，使脂肽成为控制微生物的关键因素，其抗菌机制主要包括以下几方面（见图3）：a.直接作用于病原体，造成细胞破裂进而导致菌体的死亡（图3a）；b.抑制细菌细胞生物被膜的形成（图3b）；c.激活生物系统本身的防御系统（图3c）。Lyu 等通过对艰难梭菌（）ATCC 9689 进行电镜扫描发现经解淀粉芽孢杆菌C-1 产生的脂肽（Surfactin、Fengycin 和Iturin等）处理后表面受损。渗出液包围着细菌，细胞壁和细胞膜被中断和模糊，而未经处理的细胞是光滑和不间断的。此外，随着脂肽浓度的增加，细菌被渗出液包围，这些渗出液可能是从细胞中挤出的细胞质。Iturin、Surfactin 和Fengycin 有抗真菌特性，主要基于它们破坏细胞壁的能力。不同脂肽抗菌机制的异同点汇总于表3。

表3 脂肽抗菌机制比较Table 3 Comparison of antibacterial mechanisms of lipopeptides

图3 脂肽抗菌机制Fig.3 Antibacterial mechanism of lipopeptides

Iturin 家族抗真菌的主要机制是形成嵌入细胞质膜的离子通道，增加细胞膜的通透性导致细胞质渗漏、降低线粒体膜电位和细胞核的浓缩。Iturin A 能抑制病原孢子的萌发或直接吸附到病原真菌的细胞膜上，破坏细胞膜表面张力形成孔隙，从而进一步破坏细胞膜的结构，改变细胞膜的通透性使得细胞内容物流出，导致病原真菌菌丝的分解和死亡。Bacillomycin 具有长脂肪酸链，其具有疏水性，可驱动寡聚化并中断致病真菌的细胞质膜，并产生跨膜通道，以允许关键离子如K从细胞中逸出，可能是由于疏水基团干扰细胞膜的磷脂和胆固醇，造成细胞膜穿孔，而亲水基团由七肽氨基酸组成，造成更多严重损伤，以及胞质溶胶的渗漏，同时这种机制使病原体很难对它产生耐药性。

Surfactin 能够插入细胞壁与病菌细胞质膜相互作用并产生离子孔，导致菌体结构破坏，因此可以抑制多种微生物。除此之外，Surfactin 还可与氟康唑（Fluconazole）结合使用抑制白色念珠菌的生长。同时Surfactin 可以通过抑制细菌生物膜的生成抑制细菌的生长，例如口腔致病菌血链球菌。Surfactin的抗生物膜活性已被证明对各种细菌有效，据报道，Surfactin 还能抑制不锈钢和聚丙烯表面单核增生李斯特菌、阪崎肠杆菌和肠炎沙门氏菌生物膜的形成。

Fengycin 的直接作用包括细胞膜破裂、细胞内容物流出以及最终目标微生物的细胞死亡。在Liu 等的研究中发现C16-Fengycin A 的细胞超微结构的改变和细胞壁疏水性的降低而具有破坏细胞壁的能力，另一方面C16-fengycin A 可以引起线粒体膜的电位升高和线粒体功能紊乱导致活性氧的含量升高，抑制细胞壁的合成，最终导致了细胞的死亡，以此方法可以治疗白色念珠菌的感染。Fengycin 还可以和Surfactin 协同使用来抑制疫霉菌菌丝的生长。

脂肽具有抗真菌和细菌的活性，除了直接抑制植物的病原体外，据报道脂肽在植物中还会引起对病原体的防御反应。特别是Surfactin 和Fengycin已被报道诱导系统抗性在植物中诱导防御反应，提高植物对各种真菌、细菌和病毒的防御能力。系统抵抗性（ISR）诱导引发植物防御相关蛋白的产生，如过氧化物酶（POD）、脂氧合酶（LOX）、几丁质酶（CHI）和-1，3-葡聚糖酶（GLU），以及参与植物防御的酶和抗氧化剂如超氧化物歧化酶（SOD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）等。据报道，由解淀粉芽孢杆菌FZB42 产生的Fengycin 可以导致真菌菌丝的结构变形，具有很强的抗真菌活性，通过降低真菌中次级代谢物的产生来提高谷物产量。脂肽也是导致植物系统抗性和生物被膜形成的原因，生物被膜的形成是生物防治对植物有害生物的关键因素，Bacillomycin D 也参与解淀粉芽孢杆菌生物被膜形成相关基因的表达。在环脂肽中，环化一般发生在由酰胺键连接的第一个和最后一个氨基酸之间，显示出最好的抗真菌活性。

4 结语与展望

随着人们对于微生物抗菌肽的重视，学者对于脂肽的研究及应用也逐渐增多。生物防治已成为控制多种植物病原体最有效、最环保、最无毒的选择。脂肽的特征在于结构多样性和不同的功能特性，这使得它们可以被应用于不同的领域（表4）。环脂肽在工业、环保和医药领域表现出最佳活性，一些报道显示了脂肽在抗微生物剂和抗肿瘤剂中的潜力。

表4 解淀粉芽孢杆菌中脂肽的应用Table 4 Application of lipopeptides from Bacillus amyloliquefaciens

Iturin A 主要用作生物杀虫剂，喷洒在植物叶子上以控制植物病原体。一些研究人员还发现，Iturin A 可用于动物饲料，从而提高动物免疫力，降低死亡率，促进生长，并发挥止泻作用，此外，Iturin A 还可用于治疗癌症，为癌症治疗提供了新的策略。也有报道称Iturin A 可以应用于水果的防腐保鲜如草莓，王晓琼等通过研究Iturin A 对草莓中腐败菌镰刀霉（）和灰葡萄孢霉（）的抑菌效果发现，Iturin A 可以破坏病菌的细胞膜，导致蛋白质的泄露进而达到灭菌效果。在脂肽的研究领域中，对于Bacillomycin D 的研究也比较多，在抗癌、抗霉、抗真菌等方面都具有良好作用。Lin等通过研究发现Bacillomycin D 可以诱导肺泡癌细胞凋亡，抑制其增殖；其中，Bacillomycin D-C16 对癌细胞的抑制作用最好，可以通过PI3K/Akt 和FoxO3a 信号通路触发胃癌细胞凋亡。Bacillomycin D 可与壳聚糖（Chitosan）结合使用，显示出对匍匐茎葡萄和灰霉病菌生长的协同抑制，进一步延长了樱桃番茄的货架期。Bacillomycin D 的抗真菌特性可以表现在多个方面，其可抑制多种真菌的生长。球形马拉色菌（）是一种引起各种皮肤病的机会性病原体，一直困扰着人们的生活，常规药物并不能完全令人满意。而有研究发现Bacillomycin D 分别与酮康唑和两性霉素B 在抑制球形分枝杆菌方面具有相加和协同作用，表明Bacillomycin D 与其他市售药物联合使用可能是缓解球形分枝杆菌引起的皮肤疾病的一种有前途的策略。

Surfactin 是解淀粉芽孢杆菌中另一种重要的抗菌脂肽，具有生物降解性、低毒性和生物相容性等优点。由于其表面活性性质和环境友好性，Surfactin具有很大的工业和商业价值。具有两种不同的亲和力：一种具有亲水性；另一种具有疏水性，其以脂肪酸的形式连接到极性头部，从而增加化合物的溶解度和生物利用度。该低分子量化合物具有乳化能力，可应用于不同环境中疏水性化合物的生物修复。同时Surfactin 应用于多个领域，如洗涤剂和化妆品应用、石油回收、腐蚀、生物杀虫剂等。阳离子糖肽博莱霉素（Bleomycin，BLM）是临床上用于治疗各种恶性肿瘤的广谱化疗药物，但BLM 细胞膜通透性差，易于使用高剂量，因此可能诱发剂量依赖性肺毒性，这是限制BLM 临床应用的一个难题。阴离子脂肽Surfactin 作为一种商业生物表面活性剂，因其强大的破膜能力可以改善BLM 细胞的内化，联合使用Surfactin 能显著提高BLM 或其类似物的抗肿瘤活性，而对正常细胞无明显影响。Surfactin 还在食品工业中充当高效乳化剂、稳定剂和表面改性剂。

Fengycin 在抗菌方面同样具有较强的活性，相比Surfactin 和Iturin 其溶血性质比较弱，但杀真菌的活性很强。Fengycin 也在抗肿瘤方面应用较广。脂肽还有许多潜在的工业化应用，包括提高石油采收率、原油滴油润滑剂、表面活性剂辅助水不溶性污染物的生物修复以及在医疗保健和食品加工业中的应用等。

脂肽具有低毒性、更好的生物降解性、低羧甲基纤维素、有用的物理化学性质和生物活性等独特优势，这使其在化妆品、医疗保健、生物医学、农牧业和食品工业等各个方面的应用得到了扩展。由于脂肽具有较高的稳定性、生物降解性和无毒性，研究人员认为它是生物修复应用中一种很有前途的工具。但芽孢杆菌类产脂肽的产率低、纯化困难、成本高且其中部分脂肽大规模生产技术并不完善，因此，现阶段想要生产高品质脂肽的成本还是相当高的。所以我国对于抗菌脂肽的研究还存在许多限制，目前还主要停留在对菌株的筛选和脂肽的鉴定及纯化方面，对于脂肽的提取大多也还在实验室层面。尽管对脂肽的提取还存在许多问题，但微生物类抗菌物质无毒、抗菌谱广且对环境友好，符合现阶段人们的需求，因为相比于化学类抗生素，微生物抗菌肽具有更好的发展前景。现在人们对于微生物抗菌脂肽的研究越来越多，多层面去提高脂肽的产量，众多研究者更加意识到了脂肽的良好发展，故有望将脂肽的生产进行量化，使其得到广泛应用。