脂肽类化合物发酵条件的优化及其分离工艺的初步研究

张晓慷，蒋爱忠，王海利，王滢秀，张新刚

(山东省农药科学研究院 山东省化学农药重点实验室，山东 济南 250033)

脂肽类化合物是由芽孢杆菌、假单胞菌等细菌微生物代谢产生的次级代谢产物，广泛存在于芽孢杆菌微生物农药的生产过程中[1]。由于近年来化学农药的滥用导致的残留、毒性和污染问题日益凸显，脂肽类化合物具有的环境友好、易降解、抗细菌[2-3]、抗真菌[4-5]等优点日益得到人们的关注，并在食品工业[6]、环境保护[7]、化妆品行业[8]与生物制药领域得到了不断的研究与开发。

目前，脂肽类化合物的应用前景较为广泛，具有较大的开发价值。但是，脂肽类化合物的分离工艺一直没有大的突破，现在常采用的分离手段，如制备液相色谱、分子筛排阻层析、ODS反向分配层析等精致工艺大多适用于实验室少量制备高纯度样品，难以进行工业化放大，无法满足应用化研究的需要，所以急需要开发一种规模化的制备工艺。

本课题组从前期的工作中筛选出一株对黄瓜灰霉病[9]有防效的贝莱斯芽孢杆菌，通过对其有效成分的分析与鉴定，确认了其有效成分中存在脂肽类化合物。本文对F170062菌的发酵培养条件进行了研究，并对脂肽的分离纯化工艺进行了初步探索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

生产菌株：前期筛选出的生产脂肽的菌株F170062，系贝莱斯芽孢杆菌，由山东省农药科学研究院保存。

1.1.2 培养基

C4发酵培养基：10g可溶性淀粉、20g葡萄糖、25g花生粉、1g牛肉膏、4g酵母浸粉、2gNaCl、0.05gK2HPO4，水1000mL，调节pH值=7.2，分装于250mL三角瓶中，每瓶约100mL，在121℃下湿热灭菌25min备用。

Landy发酵培养基：20g葡萄糖、5g L-谷氨酸钠、0.5gMgSO4、0.5gKCl、1g KH2PO4、0.15mg FeSO4、5mg MnSO4、0.16 mgCuSO4，水1000mL，调节pH值=7.2，分装于250mL三角瓶中，每瓶约100mL，在121℃下湿热灭菌25min备用。

1.2 方法

1.2.1 脂肽含量的测定

取生长有F170062菌的斜面接种于发酵培养基中，在28℃，转速180r/min的恒温摇床上培养数天。发酵完成后，将发酵液4000r/min离心30min，收集上清液，并用6mol/L的盐酸调节其pH值到2.0，4℃冷藏过夜，产生沉淀。离心收集沉淀，经甲醇浸提两次，过滤、浓缩溶液，获得脂肽粗提物。将脂肽粗提物定量配成甲醇溶液，采用高效液相色谱法定量测定其中脂肽含量(g/g)，或折算为脂肽在发酵液中的含量(mg/L)。

1.2.2 不同发酵时间的发酵液中的脂肽含量测定

取生长有F170062菌的斜面接种于C4培养基中，在28℃，转速180r/min的恒温摇床培养48h，作为种子液，而后按5%的种子液量接入到新发酵培养基中，在相同条件下，继续发酵，在第3，4，5，6，7天，每天取2L发酵液，按照1.2.1的方法测定发酵液中的脂肽含量。

1.2.3 溶剂沉淀试验

将脂肽粗提物按照100mg/L的浓度配成甲醇溶液，待其溶解完全后，向溶液中瞬间加入4，6，8，10倍体积的的乙酸乙酯，而后磁力搅拌溶液30min，过滤沉淀，40℃烘干，对溶剂相进行脱溶处理，后将沉淀相与溶剂相分别定量溶解在甲醇溶液中，测定其中的脂肽含量。

1.2.4 水洗工艺试验

1.2.4.1 沉淀溶解性试验

将经溶剂沉淀试验处理后的沉淀物溶解在甲醇溶液中，静置过夜，将其中的不溶物过滤，40℃的烘箱中烘干，后取10mg分别溶解在3mL的正己烷、二氯甲烷、甲醇、乙醇、正丁醇、水、乙酸乙酯等7种溶剂中，观察其溶解情况。

1.2.4.2 水洗处理试验

将经溶剂沉淀试验处理后的沉淀物放在40℃的烘箱中烘干，然后定量向其中加入蒸馏水，搅洗30min，过滤不溶物，40℃烘干，将水相脱溶，后将不溶物相与水相分别定量溶解在甲醇溶液中，测定其中的脂肽含量。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基对脂肽含量的影响

选择合适的发酵培养基对脂肽的生产与分离纯化至关重要。营养成分丰富的培养基能够提高芽孢杆菌的发酵效率，增加脂肽在发酵液中的含量，但是发酵液中较多的外源性杂质会增大脂肽的分离难度；而有利于脂肽分离的培养基往往成分比较单一，有利于脂肽的分离却不利于其发酵生产。

选择脂肽发酵常用的Landy发酵培养基[10]与本实验室自用的C4培养基，按照

1.2.1 脂肽含量的测定方法对比两种发酵培养基对脂肽发酵的影响，结果如表1所示。

表1 发酵培养基对脂肽发酵的影响Table 1 Effects of fermentation medium on lipopeptide fermentation

如表1所示，F170062菌在两种培养基中均能发酵生产脂肽。但是通过对比发现，C4培养基的脂肽发酵效率要明显高于文献中常使用的Landy培养基，脂肽在C4发酵液中的含量大约是Landy发酵液的5.6倍。但是分析脂肽在脂肽粗提物中的含量，两次甲醇浸取，Landy培养基分别高C4培养基50%及67%。通过分析两种培养基的主要营养成分可以得知，C4培养基有丰富的碳源、氮源以及其他营养成分，能够为菌株提供充足的营养物质，而Landy培养基的碳源较为单一，且有机氮源缺失，这使得菌株发酵很不充分，造成发酵产生的脂肽总量较低。然而，Landy培养基的成分以单糖及各种无机盐为主，成分简单，有利于脂肽的分离，所以，两次甲醇浸取操作脂肽在其粗提物中的的含量，Landy培养基均高于C4培养基。综上所述，考虑到脂肽总量较高会有利于其后续的分离操作，决定选择C4培养基为其发酵培养基。

2.2 发酵时间对脂肽含量的影响

脂肽一般在芽孢杆菌生长的对数期开始合成，含量增长速度稳定，在稳定期大量合成，含量增长速度加快，到了衰亡期脂肽总量基本稳定，含量不再增长[11]。所以，为了达到最大的脂肽发酵量，又不过多的浪费时间，需要确定菌株由稳定期转到衰亡期的时间点。图1反映了发酵时间与脂肽含量之间的关系。

本试验考察的发酵时间为3天至7天。当发酵时间在第3天时，测定发酵液中的脂肽含量仅为7.55mg/L，含量较低，到发酵第四天，脂肽含量也仅增长到9.62mg/L，增长速度十分缓慢，此时说明F170062菌正处于对数增长期，营养物质主要用于芽孢杆菌的增长，发酵生产的脂肽的量较少。当发酵时间到4～6天时，脂肽含量从9.62mg/L猛增到44.63mg/L，含量增长了近4倍，此时说明芽孢杆菌进入了增长稳定期，在此阶段，芽孢杆菌分泌了大量的蛋白酶，促进了营养成分的分解和吸收，合成了大量的脂肽[11]。当发酵天数到达第7天时，发酵液中的脂肽含量趋于稳定，说明此时芽孢杆菌处在稳定期与衰亡期，脂肽的合成开始减弱。综合以上分析，考虑到时间成本，发酵时间确定为6天。

图1 发酵时间对脂肽含量的影响Fig.1 Effects of fermentation time on lipopeptide content

2.3 溶剂沉淀工艺对脂肽含量的影响

高纯度脂肽本身并没有酸化沉淀的特性，但当发酵液中可酸化的杂质较多时，脂肽就会被吸附在其中跟随杂质一块沉淀下来，表现出可以被酸化沉淀的特征[12]。根据“相似相溶”原理，利用杂质与脂肽在溶液中溶解性差异，通过向脂肽粗提物的甲醇溶液中加入乙酸乙酯，瞬间降低溶液的极性，可以使脂肽从杂质中沉淀出来，从而达到分离提纯的效果。表2为乙酸乙酯与甲醇的体积比与脂肽含量之间的关系。

表2 乙酸乙酯加入体积对脂肽含量的影响Table 2 Effects of ethyl acetate volume on lipopeptide content

当乙酸乙酯与甲醇的体积比由4增加到8时，沉淀相中脂肽含量由5.70%增加到7.91%，而溶剂相中的脂肽含量由2.85%降低到了0.85%。这说明向脂肽粗提物溶液中加入乙酸乙酯，确实起到了脂肽与杂质有效分离的作用，符合前期的理论推测，脂肽粗提物中大量低极性杂质被溶解在混合溶液中，而脂肽和一部分高极性杂质则从溶液体系中沉淀出来，脂肽在沉淀相中的含量明显得到了提升。但当加入的乙酸乙酯与甲醇的体积比由8增加到10时，沉淀样品中脂肽的含量反而有所下降，这可能是由于脂肽粗提物中的一部分低极性杂质与脂肽的亲和力较强，将脂肽包裹在其中一起溶解在了溶液相，妨碍了两者的分离。所以，经过上述分析，最佳的乙酸乙酯与甲醇的体积比为8。

为了验证溶剂沉淀工艺对脂肽分离的有效性，试验中增大了脂肽粗提物的质量，并进行了三批次的重复试验，结果如下表所示。

表3 溶剂沉淀工艺验证试验Table 3 The validation test of solvent precipition

由表可知，通过对溶剂沉淀工艺进行了3次重复试验，增加了脂肽粗提物的质量，脂肽的分离效果与前期的试验结果基本一致。通过对重复试验分析发现，脂肽粗提物中低极性杂质含量较高，分离出的杂质质量占脂肽粗提物的40%～60%。通过溶剂沉淀处理，可有效去除这部分杂质，为后面的分离打下基础。

2.4 水洗处理工艺对脂肽含量的影响

经观察发现，溶剂沉淀试验处理后的沉淀相，再重新用甲醇溶解后，会有沉淀析出，这与脂肽粗提物在甲醇中的溶解性有差异。将沉淀过滤后，按照1.2.4.1的方法对其进行溶解性测试。结果发现沉淀物在正丁醇、甲醇、乙醇、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯中溶解性较差，在水中能充分溶解。对此沉淀的脂肽含量进行测定，沉淀中不含有脂肽。根据上述结果，对溶剂沉淀试验处理后的沉淀样品进行了水洗工艺探索，按照1.2.4.2方法进行了试验，试验结果如表4所示：

表4 水洗处理工艺对脂肽含量的影响Table 4 Effects of water washing process on lipopeptide content

由表4可知，通过水洗工艺处理后，较沉淀相相比，未溶解相中的脂肽含量有了大幅提升，增长了100%，而在水相中几乎没有脂肽，杂质质量去除了近30%。对上述试验结果的分析推测，由于溶剂沉淀试验分离掉了脂肽粗提物中的大部分的低极性杂质，使得杂质中的高极性杂质暴露了出来，这部分杂质由于缺少了低极性杂质的结合，其溶解性发生了改变，进而从甲醇的溶液体系中沉淀出来。利用这部分高极性杂质与脂肽溶解性之间的差异，可以非常方便的去除这部分杂质，从而提升脂肽的含量。

3 结论与讨论

脂肽类化合物由于存在产量低，难分离等问题，一直阻碍其进行实用化开发。本文通过从发酵培养基、发酵时间、分离工艺等方面对脂肽类化合物的工业化进行初步探索，着力解决其存在的问题。通过对比C4培养基与Landy培养基的脂肽发酵效率及脂肽的分离难度发现，文献报道的Landy培养基虽然有助于脂肽分离，但是发酵效率低的缺点限制了其进一步的工业化应用，C4培养基成分复杂，难以分离，但也具有脂肽发酵效率高，产量大的优势，有利于其工业化的应用。通过考察C4培养基发酵时间与脂肽含量之间的关系，确定了最佳的发酵时间，同时也从侧面推测了菌株的生长与衰亡过程。探索了溶剂沉淀工艺及水洗工艺在脂肽分离上的应用，大幅提升了脂肽的含量，而且在处理过程中尽量避免了使用柱层析、分子筛排阻层析或ODS反向分配层析等精致工艺，有利于其在工业化的应用。