敲减miR-9抑制肺非小细胞癌细胞侵袭和迁移

古卫权，杨 劼，肖 叶，杨胜利，叶 俊，王 飞，罗灵均，张小文，赵 宁

(佛山市第一人民医院胸外科，广东 佛山 528000)

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤，发病率和病死率占恶性肿瘤死亡原因首位，是对人类健康威胁最大的恶性肿瘤[1]。人非小细胞型肺癌(NSCLC)包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌，约占所有肺癌的80%[2]，但其发病和进展机制尚不完全清楚。

MicroRNAs(miRNAs，miRs)是小的非编码RNA，主要与靶基因的3′-UTR结合，并在转录水平上调节基因表达[3]。miRs已被证明在一系列恶性肿瘤发生发展中起调节作用，包括调控肿瘤细胞的增殖、侵袭以及迁移[4-5]。miR-9是miRs家族重要的成员之一，其在胶质瘤、喉癌、乳腺癌等多种人类肿瘤中发挥促癌作用[6-8]，而miR-9在NSCLC中的作用及其机制并不完全清楚。因此，本文通过RT-qPCR法研究NSCLC组织和NSCLC细胞中miR-9的表达情况，通过CCK-8和Transwell法研究抑制其表达对NSCLC细胞增殖和转移的影响，并分析其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

逆转录试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa Bio公司；RIPA裂解液、BCA试剂盒、CCK-8试剂盒、GAPDH抗体和HRP标记的二抗购自上海碧云天生物技术有限公司；miR-9-mimic、miR-9 inhibitor和阴性对照(miR-NC)、si-TET2和阴性对照(si-NC)由广州锐博生物技术有限公司合成；DMEM培养基、TRIzol试剂和Lipofectamine 2000试剂购自美国Invitrogen公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；TET2抗体购自美国Abcam公司。

1.2 临床样本获取

收集46例NSCLC患者(15例T1期、15例T2期和16例T3+T4期)的NSCLC组织和癌旁组织。所有样本采集于佛山市第一人民医院胸外科(2018年11月至2019年11月)行NSCLC切除术患者，且所有患者均已做临床和病理诊断，样本获取后快速储存于-80 ℃冰箱。本研究通过本院伦理委员会批准(No.fsykyll-lc-20181106)，且所有患者在术前均对本研究知情同意。

1.3 细胞培养

人正常肺上皮细胞(BEAS-2B)以及NSCLC细胞株A549和NCI-H1299均购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)。细胞接种于添加10%FBS、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1链霉素的DMEM培养基中，并置于37 ℃、5%CO2的细胞孵育箱中培养。

1.4 RT-qPCR

用TRIzol试剂从NSCLC组织、癌旁组织、BEAS-2B细胞以及NSCLC细胞株中提取总RNA。总RNA经紫外分光光度计定量后，每样品取2 μg总RNA通过逆转录试剂盒逆转录成cDNA。取各样本cDNA、miR-9引物和U6引物按照SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ荧光定量PCR试剂盒说明书步骤，在ABI-7300 PCR仪上进行RT-qPCR反应。反应程序设置为95 ℃预热10 min，95 ℃变性15 s，进行40个循环(95 ℃ 2 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)。引物序列为：miR-9正向引物 5′-CAGAGAAG-GGCAGTGGAGAC-3′和反向引物 5′-ACGACA-GAGACCGAAAAAGG-3′；U6正向引物 5′-CTC-GCTTCGGCAGCACA-3′和反向引物 5′-AACGC-TTCACGAATTTGCGT-3′。以U6为参照，用2-ΔΔCt法计算miR-9相对表达水平。

1.5 细胞转染miR-9-inhibitor

分别取A549和NCI-H1299细胞接种于6孔板，待细胞达到80%汇合时，用无血清和无抗生素的DMEM培养基同步化6 h，然后根据制造商说明书步骤，用Lipofectamine 2000预配制的含30 nmol·L-1miR-9-inhibitor或miR-NC的混悬液分别加入细胞，并用无血清和无抗生素的DMEM培养基孵育6 h，然后更换含10%FBS、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1链霉素的DMEM培养基继续培养48 h。

1.6 细胞增殖实验

收集已转染miR-9-inhibitor或miR-NC的A549和NCI-H1299细胞，以每孔1×104个细胞方案接种于96孔板，并在37 ℃、5%CO2的细胞孵育箱分别培养1、2、3和4 d。分别在培养时间终点时，每孔加入10 μL CCK-8溶液并孵育3 h，随后用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

1.7 Transwell实验

收集已转染miR-9-inhibitor或miR-NC的A549和NCI-H1299细胞，用无血清培养基调整细胞密度为2×105个·mL-1。取100 μL细胞悬液分别加入Transwell上室面(用于检测细胞迁移)或Matrigel包被Transwell上室面(用于检测细胞侵袭)，将600 μL含有10%FBS的培养基加入下室。37 ℃培养24 h后，4%多聚甲醛固定上室面细胞30 min，并用0.1%结晶紫染色10 min，显微镜下随机选择6个视野计数。

1.8 蛋白质免疫印迹

通过RIPA裂解液提取组织或细胞中全蛋白，每样品取40 μg蛋白进行SDS-PAGE。将电泳分离的蛋白质转移至PVDF膜，并用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜。分别采用一抗TET2(1∶1000)和GAPDH(1∶5000)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后，室温孵育HRP标记的二抗1 h。用TBST洗涤后，用ECL化学发光显影，Quantity One 软件分析条带的灰度值。

1.9 双荧光素酶基因实验

TargetScan 7.2在线软件(http://www.targetscan.org/vert_72/)显示TET2 3′-UTR存在miR-9结合位点。由广州锐博生物技术有限公司对结合位点进行点突变并构建荧光素酶报告基因pGL3-TET2 3′-UTR野生型(WT)或突变型(MUT)质粒。取已转染miR-9-mimic或miR-NC的A549细胞，再用Lipofectamin 2000分别将pGL3-TET2 WT或MUT质粒转染至细胞，转染48 h后，根据双荧光素酶基因检测试剂盒说明书步骤，分别加入PLB裂解液，提取蛋白上清液，并将上清液转移至96孔酶标板，加入反应底物后，利用Dual-Glo荧光素酶测定系统检测荧光素酶活性。

1.10 转染si-TET2和Transwell实验

取已转染miR-9-inhibitor或miR-NC的A549细胞，用Lipofectamin 2000分别将30 nmol·L-1si-NC或si-TET2分别转染至细胞。收集已转染miR-NC+si-NC、miR-9-inhibitor+si-NC和miR-9-inhibitor+si-TET2的细胞，用Transwell法检测细胞迁移与侵袭(检测方法同1.7 Transwell实验)。

1.11 统计学方法

采用SPSS20.0软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差表示，2组间比较采用t检验，多组之间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-9在各期NSCLC组织和NSCLC细胞中的表达情况

用RT-qPCR检测癌旁组织和NSCLC组织中miR-9表达情况，结果(图1A)显示：与癌旁组织[(100.24±18.46)%]相比，miR-9在NSCLC组织中相对表达水平[(656.49±29.15)%]明显升高(P<0.001)。用RT-qPCR检测不同T分期的NSCLC组织中miR-9表达情况，结果(图1B)显示：与T1期NSCLC组织[(102.36±4.52)%]相比，miR-9在T2期[(186.52±7.15)%]和T3+T4期[(323.24±12.34)%]NSCLC组织中相对表达水平明显升高(P<0.01或P<0.001)。用RT-qPCR检测人正常肺上皮细胞(BEAS-2B)和NSCLC细胞株(A549和NCI-H1299)中miR-9表达情况，结果(图1C)显示：与BEAS-2B[(98.75±28.76)%]相比，miR-9在A549[(626.24±22.13)%]和NCI-H1299[(641.56±21.39)%]细胞中相对表达水平明显升高(均P<0.001)。

A：NSCLC组织和癌旁组织中miR-9的相对表达水平,n=46；B：不同T分期(T1期n=15，T2期n=15，T3+T4期n=16)的NSCLC组织中miR-9的相对表达水平；C：BEAS-2B、A549和NCI-H1299细胞中miR-9的相对表达水平，n=3。**P<0.01,***P<0.001与癌旁组织、T1期NSCLC组织或BEAS-2B细胞比较。

2.2 敲减miR-9对NSCLC细胞增殖以及转移能力的影响

CCK-8结果(图2A)显示：A549细胞转染miR-NC后1～4 d的OD值分别为0.46±0.03、0.71±0.01、1.07±0.06和1.52±0.04，转染miR-9-inhibitor 后1～4 d的OD值分别为0.40±0.03、0.45±0.04、0.62±0.04和0.87±0.02；NCI-H1299细胞转染miR-NC后1～4 d的OD值分别为0.41±0.07、0.52±0.03、0.97±0.06和1.46±0.05，转染miR-9-inhibitor后1～4 d的OD值分别为0.35±0.03、0.39±0.02、0.48±0.0和0.56±0.04；相比于转染miR-NC细胞，A549细胞和NCI-H1299细胞在转染miR-9-inhibitor后2～4 d的细胞活性均降低(P<0.05)。Transwell结果(图2B—C)显示：A549细胞转染miR-NC和转染miR-9-inhibitor后的迁移细胞数分别为(252±18)和(85±29)个、侵袭细胞数分别为(201±11)和(56±15)个；NCI-H1299细胞转染miR-NC和转染miR-9-inhibitor后的迁移细胞数分别为(175±21)和(42±13)个、侵袭细胞数分别为(134±12)和(42±6)个；相比于转染miR-NC的细胞，A549细胞(图2B)和NCI-H1229(图2C)细胞在转染miR-9-inhibitor后的迁移细胞数和侵袭细胞数均降低(P<0.01或P<0.001)。

A：CCK-8检测A549和NCI-H1299细胞的细胞活性；B：Transwell检测A549细胞的侵袭与迁移；C：Transwell检测NCI-H1229细胞的侵袭与迁移。**P<0.01、***P<0.001与miR-NC组比较,n=4。

2.3 miR-9靶基因验证

Western blot结果(图3A)显示：与BEAS-2B细胞[(101.25±8.46)%]相比，TET2在A549[(21.34±3.37)%]和NCI-H1229[(26.59±2.13)%]细胞中相对表达水平均明显降低(P<0.001)。TargetScan在线软件显示TET2 3′-UTR存在miR-9结合位点(图3B)。双荧光素酶报告基因检测结果(图3B)显示：相对于miR-NC+WT组[(98.56±5.24)%]，miR-9-mimic+WT组相对荧光素酶活性[(28.43±3.15)%]明显降低(P<0.001)；而相对于miR-NC+MUT组[(102.34±6.17)%]，miR-9-mimic+MUT组相对荧光素酶活性[(103.79±7.23)%]无明显变化(P>0.05)。提示：TET2是miR-9的潜在的靶基因。

A：Western blot检测BEAS-2B、A549和NCI-H1229细胞中TET2的相对表达水平；B：TargetScan筛选结果和双荧光素酶检测结果。***P<0.001与BEAS-2B细胞或miR-NC+WT组比较,n=3。

2.4 miR-9通过TET2影响A549细胞侵袭和迁移能力

将si-TET2转入已转染miR-9-inhibitor的A549细胞中，通过Transwell法检测细胞侵袭及迁移，结果(图4)显示：与转染miR-9-inhibitor+si-NC细胞的迁移细胞数[(78±6)个]和侵袭细胞数[(61±12)个]比较，转染miR-9-inhibitor+si-TET2的A549细胞的迁移细胞数[(156±11)个]和侵袭细胞数[(121±8)个]均明显增加(P<0.01)。

A：A549细胞侵袭与迁移的代表性Transwell图；B：细胞迁移与侵袭的统计数据。***P<0.001与miR-NC+si-NC组比较，##P<0.01与miR-9-inhibitor+si-NC组比较，n=4。

3 讨论

目前NSCLC传统化疗方案因存在耐药和无法彻底杀死肿瘤干细胞，从而导致NSCLC的高复发率[9]。了解NSCLC的进展机制有助于NSCLC的治疗。

miRNA在NSCLC的发病过程中具有重要作用[10]。miR-9被报道在胶质瘤、喉癌和乳腺癌中表达升高[6-8]，而在胃癌和宫颈癌中显著下调[11-12]，这体现了miR-9在不同的肿瘤中表达的特异性。然而，miR-9在NSCLC细胞中的表达及作用机制并不明确。本研究检测NSCLC患者癌组织中miR-9的表达，结果显示，在NSCLC组织中miR-9表达明显升高，且随着临床分期递增。另外，本研究在A549和NCI-H1229细胞同样发现了miR-9高表达。这些结果提示miR-9可能在NSCLC的进展中发挥作用。为验证miR-9在NSCLC细胞中的作用，本研究将miR-9-inhibitor转染至A549和NCI-H1299细胞，发现敲减miR-9可显著降低NSCLC细胞增殖能力、侵袭和迁移。这些结果证明了敲减miR-9可抑制NSCLC的发展。

miRNA可通过靶基因发挥其生物学作用[3]。本研究通过靶基因预测软件发现TET2是miR-9潜在的靶基因。TET2是生物体内一种α-酮戊二酸和Fe2+依赖的双加氧酶，是DNA去甲基化过程中的一种重要的酶，在肿瘤中发挥重要作用[13]。TET2在NSCLC中发挥抑癌因子的作用[14-15]。本研究显示，TET2在A549和NCI-H1299细胞中表达异常降低，且TET2是miR-9的靶基因。为进一步研究TET2在miR-9调节NSCLC迁移与侵袭中的作用，本研究抑制A549细胞中miR-9的表达并同时干扰了TET2水平，结果显示，干扰TET2表达可抑制miR-9敲减对A549细胞迁移与侵袭的抑制作用。以上结果提示，敲减miR-9通过TET2发挥抑制NSCLC细胞迁移与侵袭。

综上，本研究证明了miR-9在NSCLC组织及NSCLC细胞中高表达，而敲减miR-9通过作用于TET2抑制NSCLC细胞增殖和转移。本研究为NSCLC的治疗提高了新的靶点。