印片细胞DNA定量分析联合冰冻切片在术中快速诊断中的应用

徐 姗，黄 燕，盛以芸，淦柳根，梅金红

(1.南昌大学第一附属医院病理科,南昌 330006；2.抚州市临川区人民医院病理科,江西 抚州 344000)

术中快速病理诊断是临床病理工作的难点之一。病理医师需快速确定病变的性质，从而指导手术方案的制定。冰冻切片是目前运用最广泛的术中快速病理诊断方法，受病理医师技术水平、诊断经验等因素的限制，许多医院尤其是基层医院仍无法开展术中冰冻切片或开展不顺利；细胞印片操作简单，但只能观察细胞形态，局限性大。DNA定量分析是一种通过定量检测细胞核内DNA含量的变化来判断细胞的生理状态或病理改变的技术，其受细胞形态、玻片背景(如血液、炎症等)、病理医师技术和经验等因素影响较小，检测结果稳定、可靠、重复性高。本研究应用印片细胞DNA定量分析联合冰冻切片对术中标本的病变性质进行判断，探讨二者联合检测在术中快速诊断中的价值。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2013年3月至2015年3月南昌大学第一附属医院术中送检标本237例，患者年龄19～92岁，平均47岁；其中头颈部病变90例(包括甲状腺结节56例、口腔及涎腺病变34例)、乳腺包块61例、子宫及附件病变59例、肺部结节5例、脑部病变6例、肾及膀胱病变3例、胃肠及胆囊病变13例。术中均做印片细胞DNA定量分析及冰冻切片，以常规石蜡切片病理诊断结果为对照标准。本研究已通过南昌大学第一附属医院伦理委员会审核，所有患者均已签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 印片细胞DNA定量分析

新鲜标本充分暴露，选取不同的病变部位，用滤纸或无菌纱布吸干表面的组织液，用干净的玻片稍用力压；对质地坚韧的间叶源性肿瘤，用刀在切面上刮数次或切取微小组织，将组织颗粒涂于玻片上。印片范围近玻片的2/3。采用经本实验室实验改良后的Feulgen染色法，细胞印片微热风干，迅速放入5 N盐酸中，50 ℃孵育箱酸解5 min，水洗数秒后加入Feulgen液显色，50 ℃孵育箱染色7 min，水洗数秒，梯度酒精快速脱水，风干，封片。Feulgen染色后用全自动DNA倍体细胞定量分析检测仪(麦克奥迪医疗诊断系统有限公司)对全片进行扫描，经专门的分析和诊断软件处理，对印片不少于200个细胞核内的DNA含量进行定量检测，打印DNA倍体分析直方图和细胞点阵分布图完成检测报告。当DNA指数(DI)>2.5时，必须在显微镜下逐一进行核对，以排除系统将杂质或重叠的细胞核误认为肿瘤细胞或异常细胞。阳性标准：1)可见DNA倍体异常细胞(DI≥2.5)；2)出现异倍体峰。

1.2.2 冰冻切片制作及病理诊断

冰冻切片HE染色，由两位病理医师(至少一位为副主任医师)进行术中快速诊断。

1.2.3 常规石蜡切片制作及病理诊断

标本经充分取材、脱水、石蜡包埋、切片、HE染色后由两位主治以上职称的病理医师采用双盲法进行病理诊断，必要时行免疫组织化学、特殊染色及分子检测辅助诊断。

1.2.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计数资料以百分率(%)表示，组间比较采用χ2检验；以常规石蜡切片病理诊断为标准，计算敏感度、特异度及误诊度。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同诊断方法敏感度和特异度的比较

237例标本中经常规石蜡切片诊断确诊为恶性肿瘤者69例，良性病变168例。69例恶性肿瘤中冰冻切片诊断敏感度和特异度分别为95.65%、89.29%；印片细胞DNA定量分析敏感度和特异度分别为73.91%、92.86%。1例乳腺癌患者印片DNA定量分析发现538个异倍体细胞、冰冻切片及常规石蜡切片均见大量肿瘤细胞核大、不规则，染色质粗，呈浸润性生长。见封三图1。去除冰冻切片诊断中12例可疑恶性病例，54例恶性标本进行联合检测分析，敏感度和特异度分别为73.91%、76.79%。DNA定量分析及冰冻切片的敏感度与联合检测比较，其差异均无统计学意义(均P>0.05)；联合检测与DNA定量分析诊断的特异度比较，其差异无统计学意义(χ2=3.69，P>0.05)，但与冰冻切片诊断的差异有统计学意义(χ2=59.784，P<0.001)。见表1。

A：印片细胞DNA定量分析见538个异倍体细胞；B：冰冻切片病理诊断为浸润性癌(HE，×200)；C:石蜡切片病理诊断为浸润性癌，非特殊类型(HE，×200)。

表1 不同诊断方法敏感度、特异度和误诊度的比较 例

2.2 不同诊断方法误诊度的比较

168例良性病变中，印片细胞DNA定量分析、冰冻切片及联合检测的误诊度分别为7.14%、10.71%、1.79%。联合检测的误诊度明显低于冰冻切片诊断和DNA定量分析(χ2=10.10，P<0.01；χ2=5.17，P<0.05)。见表1。

2.3 不同诊断方法在头颈部病变诊断中的比较

90例口腔及甲状腺病变中，恶性肿瘤30例，良性病变60例。恶性肿瘤中，印片细胞DNA定量分析的敏感度、特异度及误诊度分别为40.0%、85.0%、15.0%；冰冻切片的敏感度、特异度及误诊度分别为90.0%、85.0%、15.0%。恶性肿瘤中未检出异倍体细胞18例，包括12例甲状腺乳头状癌、2例甲状腺结外边缘区黏膜相关淋巴组织B细胞淋巴瘤、3例舌的高分化鳞状细胞癌、1例腮腺的肌上皮癌；良性病变检出异倍体细胞9例，包括2例腮腺多形性腺瘤、1例腮腺淋巴上皮病变、6例桥本甲状腺炎。联合检测的敏感度与冰冻切片相比，差异无统计学意义(χ2=0.05，P>0.05)；联合检测的敏感度比DNA定量分析高(χ2=8.58，P<0.01)。3种诊断方式的特异度和误诊度相同。见表2。

表2 不同诊断方法在头颈部病变中的比较 例

3 讨论

为帮助基层医院基于术中快速病理诊断开展更多手术，近年江西省卫生和计划委员会在部分基层医院投放了冰冻切片机，但预期效果不佳。冰冻切片诊断结果虽是手术方案制定的重要依据，但其诊断基于形态学检查，对病理医生和技师的资质、经验、能力等均有较高的要求。因此，寻找新的技术辅助冰冻切片诊断将有助于基层医院更好地开展术中快速病理诊断。

肿瘤病理学研究[1-2]表明，当细胞癌变时，细胞核内DNA的结构和含量均发生异常改变，表现为DNA含量增多、DNA倍体异常，故肿瘤细胞内DNA的含量可作为判断恶性肿瘤的指标之一。DNA定量分析法已广泛应用于宫颈液基细胞学检查，亦有部分应用于胸腹水恶性细胞及尿液脱落细胞的诊断[3-7]。另有报道[8-9]显示DNA定量分析法可应用于子宫内膜癌的诊断及肺腺癌胸腔积液中EGFR基因突变的判断。但是，DNA定量分析法应用于术中快速病理诊断的报道较少，其原因是传统的DNA定量分析法时间较长(染色200 min、DNA扫描8 min)，无法达到术中快速诊断的要求。基于此，本研究对传统染色方法进行改良，使染色时间缩短至12 min，而且改良前后的染色效果无明显差异，对DNA定量分析结果亦无影响。类似的染色改良法也被应用于宫颈脱落细胞的研究中[10]。

本研究以常规石蜡切片诊断结果为对照标准，结果显示联合检测的误诊度比DNA定量分析及冰冻切片均低，这提示联合检测可以提高术中快速诊断的准确性。特别在冰冻切片制片不佳或疑难病例诊断时，DNA定量分析可辅助冰冻切片诊断。

本研究显示，未检出异倍体细胞的误诊病例均为头颈部恶性肿瘤，且以甲状腺乳头状癌的误诊病例最多，其原因可能是：1)肿瘤的恶性程度低；2)肿瘤的增殖指数Ki67表达低，DNA增殖不如其他恶性肿瘤活跃；3)肿瘤部分为微小癌，印片取材较困难，致使异倍体细胞不容易检出。但有学者[11]检测1284例甲状腺冰冻标本，发现DNA定量分析的准确性达95.3%，这与本研究结果不一致。本研究中，良性病变检出异倍体细胞的误诊病例12例，其中头颈部病变9例，大部分与淋巴细胞增生相关；另外，乳腺普通型导管上皮增生2例，外阴乳头状瘤伴HPV16/18感染1例；DNA定量分析均检出DI值2.0～2.5的异倍体细胞，推测这可能与细胞增殖较快或病毒感染导致四倍体细胞增多有关。因此，本研究提示，在头颈部病变中冰冻切片诊断具有更高的敏感度和更低的误诊度；DNA定量分析在头颈部病变诊断中的作用需扩大样本量进一步研究。同时，本研究显示，在头颈部病变中无论冰冻切片还是DNA定量分析，其诊断结果与常规石蜡切片无显著差异，提示联合检测在头颈部病变诊断中作用有限。

综上，DNA定量分析联合冰冻切片可提高术中快速诊断的准确性，在临床特别是基层医院具有一定的应用价值，但对于头颈部病变诊断作用有限。