矿物质复合微量元素对嗜酸乳杆菌效能影响的初步研究

黄金珠， 朴金一， 姜成哲

（延边大学农学院，吉林延吉133002）

自然界约存在70 多种在人体中含量极低的微量元素，其中一部分就分布在土壤矿物质中。微量元素在生物体中虽然含量极微小， 但对生物机体的正常运转却起着巨大的作用。它们参与酶、激素、维生素和核酸的代谢过程，缺少微量元素会导致各种疾病的发生。 微量元素对人和动物甚至微生物都能产生很大的影响， 在不同微量元素丰富的环境下培养的微生物会产生原有功能的提升或下降（王立芳，2019）。

乳酸菌是一类利用无氧呼吸将碳水化合物转化为乳酸的细菌。乳酸菌在自然界分布极为广泛，包含18 个种，200 多个属， 是人体不可缺少的最重要的益生菌之一，其被广泛运用在医药、食品、保健方面。 不同的微量元素对于乳酸菌的影响也不尽相同（王明玥等，2020； Feng 等，2016）。 目前富硒、锗、锌、铜的乳酸菌都已经有很多研究成果，但对于复合矿物微量元素对于乳酸菌功能影响的研究还比较缺少， 因此本试验通过体内和体外试验， 研究矿物复合微量元素对乳酸菌益生性能的影响，并为相关疾病治疗提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料 嗜酸乳杆菌来自延边大学微生物实验室， 普通培养的嗜酸乳杆菌组命名为C 组， 添加矿物微量元素培养的嗜酸乳杆菌命名为K 组。本试验中添加的矿物复合微量元素K 制剂为延边某公司研制中的保密配方制品。

1.2 试验动物与分组 试验选取60 只6 周龄昆明鼠，雌雄各半。 采用随机分组法将雌雄小鼠各分为3 组，每组10 只，分别为空白组、对照组、试验组。其中空白组饲喂不添加任何物质的普通饮用水， 对照组饲喂添加2%浓度为108cfu/mL普通嗜酸乳杆菌的饮用水， 试验组饲喂添加2%浓度108cfu/mL 矿物复合微量元素嗜酸乳杆菌的饮用水，共喂养28 d。

1.3 主要试验试剂 无水葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、谷氨酸钠、醋酸钠、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁、氯化钠、邻二氮菲、无水乙醇、磷酸二氢钾、DPPH、过氧化氢、抗坏血酸、胆固醇、牛胆盐、盐酸、氯化钠、氢氧化钠等为分析纯试剂；MRS 培养基、胃蛋白酶、琼脂、K 制剂、总胆固醇试剂盒、甘油三酯试剂盒，长春汇力生物技术有限公司。

1.4 主要仪器 高速离心机，上海继谱电子科技有限公司；恒温培养箱，上海捷呈试验仪器有限公司；分光光度计，杭州俊升科学器材有限公司；紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司；疲劳转棒仪，成都泰盟软件有限公司；电子天平，万特电子有限公司。

1.5 体外试验

1.5.1 耐胆盐试验 将活化的嗜酸乳杆菌以5%的接种量接种到已处理的培养基内， 培养温度为37 ℃，培养时间为24 h，分别对以上浓度的培养基的OD 值在620 nm 加以测定，对嗜酸乳杆菌对胆盐的耐受力进行运算，计算公式为：

嗜酸乳杆菌存活率/%=含胆盐的培养基的OD 值/空白培养基的OD 值×100。

1.5.2 嗜酸乳杆菌降胆固醇能力的测定 按照试剂盒说明书测定胆固醇含量； 降解率换算如下：

胆固醇降解率/%=[胆固醇含量（空白）-胆固醇含量（测量）]/OD 空白×100。

1.5.3 羟自由基清除能力的测定 在536 nm 下分别测量各组混合溶液的吸光度值得As，以蒸馏水代替样品作为空白组测吸光度值得Ab，以蒸馏水替代H2O2作为损伤组，测其吸光度值An，以抗坏血酸代替样品作为阳性对照， 抗氧化剂的羟自由基清除率按以下公式计算：

羟 自 由 基 清 除 率/%=[（As-An）/（Ab-An）]×100。

1.5.4 DPPH 自由基清除率的计算 本试验中选取了嗜酸乳杆菌C 组、K 组样本进行DPPH 清除率的测定与比对。

试验方法： 向2 mL 的1.5×10-4mol/L DPPH溶液中加人2 mL 试样，总体积4 mL。摇匀后于室温下放置30 min 后， 于光径1 cm 比色皿中测定DPPH 混合溶液在517 nm 处的OD 值。

抑制率/%＝（Ai-Aj）/Ac×100%；

DPPH 清除率/%＝1-G%；

式中：Ai 为2 mL DPPH 液+2 mL 提取液的吸光度，Aj 为2 mL 提取液+2 mL 溶剂的吸光度，Ac为2 mL DPPH 液+2 mL 溶剂的吸光度。

1.6 体内试验

1.6.1 抗疲劳测试 小鼠抗疲劳测试需运用疲劳转棒仪，提前设定转速为20 r/s，将小鼠放在转棒上即可开始测试，小鼠掉落后会自动停止计时。每只小鼠重复三次。

1.6.2 丙二醛含量的测定 吸取2 mL 的提取液于刻度试管中， 加入0.5%硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液3 mL，于沸水浴上加热10 min，迅速冷却， 于4500 r/min 离心10 min。 取上清液于532、600 nm 波长下， 以蒸馏水为空白调透光率100%，测定吸光度。

丙二醛含量/（nmol/g）=（A532-A600）×反应液总量（5 mL）×V1.55×10-1×植物样品重量（0.5 g）×反应液中的提取液数量（2 mL）；

式中：A 为吸光度；1.55×10-1为丙二醛的微摩尔吸光系数（在1 L 溶液中含有1 μmol 丙二醛时的吸光度）。

1.6.3 超氧化物歧化酶含量的测定 样品超氧化物歧化酶（SOD）比活力/（U/mg）= 单位体积活力（U/mL）/样品的蛋白含量（mg/mL）。1.6.4 谷胱甘肽过氧化物酶含量的测定 将1 mL样品和1 mL 0.1 mol/L 的四氧嘧啶溶液加入到测定管内混匀， 再向其中依次加入1 mL，0.5 mol/L的且pH 为7.5 的磷酸盐缓冲液以及0.1 mol/L 的氢氧化钠溶液，混匀。 6 min 后，加入1 mol/L 的氢氧化钠溶液，混匀，用紫外分光光度计于305 nm处测量光密度，读取各管读数。以此计算得到谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）浓度。

1.6.5 血清胆固醇和甘油三酯的测定 根据试剂盒说明书进行胆固醇和甘油三酯的测定。

1.7 数据统计分析 所有数据均应用SPSS 13.0统计软件进行分析，计算P值。 若P＞0.05，则统计学上无显著差异，若0.01 ＜P＜0.05，则在统计学上具有显著差异，若P＜0.01，则在统计学上具有极显著差异。

2 结果与分析

2.1 体外试验

2.1.1 嗜酸乳杆菌培养 嗜酸乳杆菌培养24 h，革兰氏染色后镜下观察到典型的乳杆菌。

2.1.2 耐胆盐 嗜酸乳杆菌在动物体内能否发挥其益生作用， 与嗜酸乳杆菌在动物体内的存活率有关。如果嗜酸乳杆菌不能具有一定的耐酸、耐胆盐能力，即使有较强的降解胆固醇能力，由于其在体内存活率过低也无法发挥作用。 一般人体内胆盐浓度为0.15% ～0.3%， 所以本试验设定了0%～0.3%的胆盐浓度来观察复合矿物微量元素是否有提高嗜酸乳杆菌耐胆盐功能的效果。 测定结果如表1。 在0% ～0.3%胆盐浓度下，K 组存活率分别比C 组提高0.4%、0.4%、5.8%、20.8%， 试验结果表明， 矿物复合微量元素对于嗜酸乳杆菌的耐胆盐能力有所提升。

表1 不同浓度胆盐环境下嗜酸乳杆菌的存活率比较%

2.1.3 降解胆固醇能力 由表2 可知，K 组的胆固醇降解能力比C 组提高27.9%。在体外环境中，嗜酸乳杆菌具有一定的胆固醇降解能力， 且矿物复合微量元素一定程度上提升了嗜酸乳杆菌的降解胆固醇能力。

表2 嗜酸乳杆菌降解胆固醇能力比较%

2.1.4 羟自由基清除率 C 组羟自由基清除率为33.00%，K 组自由基清除率为37.77%（图1）。K 组较C 组对羟自由基的清除率有一定程度的提升。

2.1.5 DPPH 清除率 DPPH 法是一种过程简单快速的测试样品自由基清除能力的试验方法。 由表3 可知，K 组对DPPH 清除率较C 组有所上升。即矿物复合微量元素使嗜酸乳杆菌的清除自由基能力有所提高。

图1 嗜酸乳杆菌羟自由基清除率对比

表3 嗜酸乳杆菌对DPPH 的清除率%

2.2 体内试验

2.2.1 抗疲劳试验 由表4 可知， 公鼠组试验组与对照组相比显著提升了试验时长， 可以说明矿物复合微量元素嗜酸乳杆菌相比普通嗜酸乳杆菌对于机体的抗疲劳能力有显著的提高效果。 母鼠组空白组与对照组抗疲劳试验的时长没有显著提升，但试验组与空白组有极显著差异，时长大幅提升， 说明复合矿物微量元素嗜酸乳杆菌相比普通嗜酸乳杆菌能起到提升耐力的作用。

表4 抗疲劳试验结果对比

2.2.2 超氧化物歧化酶含量测定结果 鼠肝肾组织SOD 测定结果如表5。结果表明，试验组和对照组公鼠肝肾SOD 含量对比空白组均有一定程度的提升，但差异均不显著（P＞0.05）。 对照组和试验组母鼠肝脏SOD 含量均显著高于空白组，试验组与对照组虽然无显著差异，但SOD 仍有小幅度提升。 试验结果表明嗜酸乳杆菌对于母鼠肝脏SOD 有显著提升效果。

2.2.3 丙二醛含量测定结果 小鼠肝肾组织MDA 含量的测定结果如表6。 结果表明，使用嗜酸乳杆菌后公鼠的肝肾MDA 值没有显著差异，说明在昆明鼠公鼠体内氧化平衡稳定，没有产生自由基过量而带来的氧化损伤。 对照组和试验组母鼠肝脏MDA 较空白组极显著降低，说明嗜酸乳杆菌对于提升机体抗氧化能力效果极好。 对照组和试验组肾脏MDA 含量较空白组极显著降低，试验组与对照组对比MDA 含量显著下降，表明复合矿物微量元素提升了嗜酸乳杆菌的抗氧化作用。

表5 肝肾组织SOD 含量U/mg

表6 肝肾组织MDA 含量μmol/mg pro

2.2.4 谷胱甘肽过氧化物酶含量测定结果 小鼠肝肾组织GSH-Px 含量测定结果如表7。 空白组、对照组、试验组公鼠与母鼠肝肾组织的GSH-Px 含量并无明显变化，试验结果表明此嗜酸乳杆菌提高机体抗氧化能力并不是通过提升GSH-Px 含量实现的，而是通过其他机制。 而复合矿物微量元素对于嗜酸乳杆菌提升GSH-Px 的能力并无影响。

表7 肝肾组织GSH-Px 含量U/mg pro

2.2.5 血清总胆固醇测定结果 由表8 可知，对照组公鼠的胆固醇含量极显著高于空白组， 说明此嗜酸乳杆菌对昆明公鼠使用时， 产生了使血清总胆固醇升高的效果。 对照组与试验组虽然无明显差异， 但数值上可见血清总胆固醇含量有一定幅度的降低。 可见加入复合矿物微量元素培养的嗜酸乳杆菌相比加入普通嗜酸乳杆菌对于降低血清总胆固醇起到了一定的效果。

表8 胆固醇测定结果mg/mL

对照组和试验组母鼠组血清总胆固醇含量较空白组显著降低。 试验组与对照组并无明显的差异，都有很好的降低血清总胆固醇的效果。而公鼠组饮用了加入嗜酸乳杆菌的水后， 胆固醇反而比空白组要高，推测可能与性别差异有关。且本试验结果与体外胆固醇降解的试验结果相对应， 说明矿物复合微量元素确实提升了嗜酸乳杆菌降低胆固醇的能力。

2.2.6 甘油三酯测定结果 由表9 可知， 公鼠的对照组与空白组无显著差异， 而加入矿物复合微量元素培养的试验组甘油三酯含量较空白组显著降低。 试验组的甘油三酯含量较对照组极显著降低， 表明复合矿物微量元素培养的嗜酸乳杆菌对降低甘油三酯效果非常明显。 说明复合矿物微量元素使嗜酸乳杆菌降低甘油三酯的能力极显著的提高。而在母鼠组中，对照组和试验组甘油三酯含量较空白组显著降低，试验组对比对照组，甘油三酯含量有一定程度降低。 总体来讲复合矿物微量元素对嗜酸乳杆菌降低血清甘油三酯的能力是有一定提升的。

表9 甘油三酯含量测定结果mg/mL

3 讨论

乳酸菌种类繁多， 大多数都具有很好的益生效果，目前对于嗜酸乳杆菌功能性的研究有很多。赵瑞香等（2014）在对嗜酸乳杆菌同化吸附胆固醇作用机理的研究中发现， 嗜酸乳杆菌能够有效地降低血清及培养介质中的胆固醇含量， 其作用机制主要是菌体吸收同化胆固醇于自身细胞内，从而使自身脂肪酸的组成发生改变， 达到降低胆固醇的作用。 张雅茹等（2017）在嗜酸乳杆菌对高脂模型小鼠影响的试验研究中发现，嗜酸乳杆菌能有效降低小鼠血清总胆固醇和甘油三酯的含量。罗波文等（2020）在研究中发现，当嗜酸乳杆菌浓度高于1.0×108cfu/mL 时， 能有效促进IPEC-J2的生长，并在一定程度上缓解H2O2导致的IPECJ2 氧化损伤， 使细胞的抗氧化能力得到显著提升，并且能够降低IPEC-J2 氧化损伤时胞浆内紧密连接蛋白的表达量， 使细胞紧密连接的屏障作用得到有力保障， 从而实现对细胞活力的提升。本试验对于这些嗜酸乳杆菌主要具有的益生功能做出了常规培养嗜酸乳杆菌与添加复合矿物微量元素培养嗜酸乳杆菌的比较。 通过试验发现复合矿物微量元素对于嗜酸乳杆菌的多种益生功能具有提升的效果， 且在小鼠雌雄性别中使用存在一定的差异性。 本试验不单单使用一种微量元素作为培养基添加剂， 复合微量元素具有一次性补足多种微量元素的效果， 使得嗜酸乳杆菌的功能性提升幅度更大，涉及到能提升功能的范围更广。

4 结论

通过试验结果可知， 添加矿物复合微量元素培养的嗜酸乳杆菌，在抗氧化，降低胆固醇和甘油三酯，抗疲劳，提升饲料利用率等功能上较普通的嗜酸乳杆菌均有一定程度提升的效果。