缫丝废水发酵产果胶酶的条件优化研究

何海燕， 付 跃， 覃拥灵

（1.河池学院化学与生物工程学院，广西宜州546300；2.河池学院农业生物技术应用研究中心，广西宜州546300）

饼粕类饲料原料中添加果胶酶对肉鸡回肠氨基酸消化率和代谢能有促进作用；高纤维饲粮中添加果胶酶对鹅生长性能、屠宰性能及肉品质也有良好影响；日粮中添加适量的果胶酶制剂能够有效地提高鹅对营养物质的消化吸收率。研究表明，果胶酶可作为一种绿色饲料添加剂（毛倩倩等，2013；王宝维等，2011；荆丽珍等，2007；许毅，2004）。缫丝废水是缫丝厂制丝过程中产生的主要排放物（王家德等，2002），随着养蚕业和缫丝工业的快速发展， 缫丝废水的排放量不断增加，直接排放的废水会因其含有丰富的有机物而对河道产生较大污染 （石华月等，2019； 杜元源等，2017）。已有的研究大多侧重于丝胶蛋白质的回收利用，对废水回收利用的研究则较少，随着我国水资源的缺失及政府对水资源保护的重视，缫丝厂用水成本逐渐增加，缫丝废水的再利用已经成为缫丝厂降低成本、提高经济收入的重要环节（黄继伟等，2013；孔育国，2007）。 为充分利用缫丝废水无毒、 富含丝胶等高分子蛋白有机物，氮和磷含量较高的特点（黄予奕，2018），本研究在前期菌种筛选诱变的基础上，开展了以缫丝废水为主要发酵原料生产果胶酶的试验，初步优化了发酵产酶工艺，以期为缫丝废水的处理及循环利用提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料 沙福芽孢杆菌 （Bacillus safensis），编号G7-7，前期试验筛选诱变保藏。 发酵原料缫丝废水由广西嘉联丝绸厂提供，放置于冰柜，4 ℃冷藏备用。

1.2 培养基 斜面培养基：1.5%蛋白胨，0.5%酵母膏，1%氯化钠，琼脂2%。种子培养基：蔗糖1 g，酵母粉0.5 g， 氯化钠0.1 g 溶于100 mL 缫丝废水，pH 9.0。发酵培养基：桔皮粉5 g，蔗糖5 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸铁0.2 g，溶于1000 mL 缫丝废水，pH 9.0。

1.3 主要仪器 ZWY-2102 型立式全温度恒温摇床 （上海上海智城分析仪器制造有限公司），TDL-5-A 大容量离心机（上海安亭科学仪器厂），infinite M200PRO 全波长酶标仪 （上海精密科学仪器有限公司），PHS-3B 型pH 仪（上海精密科学仪器有限公司），PXY-DHS-400BS 型隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）。

1.4 粗酶液制备 保藏菌种斜面活化后取2 环转入种子培养基，30 ℃恒温培养1 d，再按10%接种量接种至发酵培养基中， 摇床150 r/min、30 ℃恒温培养3 d，发酵结束后取发酵液离心，上清液即为提取的粗酶液，4 ℃保存备用。

1.5 果胶酶酶活力测定 3，5-二硝基水杨酸（DNS）法，参考王小敏等（2007）的方法适当改良，配制0.4%的果胶底物溶液，50 ℃水浴反应30 min后，加3 mL DNS 终止反应，沸水浴10 min，流水冷却后定容至15 mL， 摇匀，540 nm 波长测定吸光值。 在上述反应条件下，每分钟催化果胶底物产生1.0 μmol 半乳糖醛酸所需要的酶量定义为一个酶活力单位（U）。

1.6 产酶条件优化

1.6.1 单因素试验 选取接种量、 发酵培养基蔗糖添加量、发酵培养基初始pH、发酵温度、发酵时间和不同诱导物6 个因素， 研究其对果胶酶产量的影响。

1.6.2 正交试验 根据单因素试验结果， 选取各因素中酶产量较显著的水平设计正交试验， 研究产酶条件的最佳组合。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 接种量对产酶的影响 接种量的大小会影响发酵培养基中菌体数量的多少， 进而影响菌体的生理状况及代谢产物的合成（刘冬，2015），因此也是发酵工艺重点考察的因素。 本研究按不同接种量把种子培养液接入发酵培养液考察接种量对产酶的影响，结果如图1，当接种量为14%时，单位体积的酶活力最高，后继试验接种量为14%。

2.1.2 发酵培养基蔗糖添加量对产酶的影响 考虑到缫丝废水中含有丰富的氮源而缺乏微生物生长必需的碳源， 本试验研究在发酵培养基中添加了一定量的蔗糖以促进微生物菌体的增殖从而促进酶的合成。 结果如图2， 当蔗糖添加量为9 g/1000 mL 缫丝废水时，单位体积的酶活力最高。

图1 接种量对产酶的影响

图2 发酵培养基蔗糖添加量对产酶的影响

2.1.3 发酵培养基初始pH 对产酶的影响 不同菌株对pH 的耐受能力也不同， 本试验所用菌株为前期试验从pH 较高的缫丝废水中筛选诱变所得，试验结果显示该菌株能耐受较高的pH， 在试验取值范围内，当pH 为9.0 ～9.5 时，酶活力较高（图3）。

图3 发酵培养基初始pH 对产酶的影响

2.1.4 温度对产酶的影响 温度不仅影响菌体生长， 同时也极大影响产物合成及发酵液的理化性质， 是发酵中重点控制的因素， 本试验结果显示（图4），温度为30 ～39 ℃时，单位体积发酵液的酶活力变化不大，说明温度对产酶影响不显著，该菌株能适应较宽的温度变化。

2.1.5 不同发酵时间对产酶的影响 如图5 所示，随着发酵时间的延长，酶活力逐渐增强，培养到84 h 时酶活最高，随后培养液中养料被耗尽，菌体生长缓慢，细胞发生自溶，酶活力又呈下降趋势。

图4 温度对产酶的影响

图5 不同发酵时间对产酶的影响

2.1.6 不同诱导物对产酶的影响 添加诱导物是提高酶产量的主要措施之一， 试验参考文献及结合地方丰富农业废弃物资源选取了富含果胶质的蚕沙、菠萝皮、橘皮粉、麸皮、米糠作为产酶诱导物添加到发酵培养基中， 比较不同诱导物对产酶的影响，结果如图6 所示，在添加量都为5%的试验条件下，蚕沙的产酶效果优于其他诱导物。

图6 不同诱导物对产酶的影响

2.2 正交试验结果 根据单因素试验结果，选择接种量、发酵液蔗糖添加量、发酵液初始pH、发酵时间四个因素， 利用正交设计助手Ⅱv3.1 设计正交试验并进行数据分析，研究最优发酵条件组合，试验因素水平表和结果见表1 ～3。

表1 正交试验因素水平表L16（45）

表2 L16（45）正交试验结果及极差分析

表3 试验结果方差分析

由表1 和表2 分析得知，R值（极差）的大小排序依次为B＞D＞C＞A， 即对产酶影响最大的是蔗糖添加量，其次为发酵时间、发酵液初始pH和接种量，接种量影响最不显著。 从表2 中K 值可知，最优发酵组合为A4B4C4D2，即接种量16%，发酵液蔗糖添加量1.1%， 发酵液初始pH 9.5，发酵时间84 h。 由于正交设计表中没有与此相同的发酵组合， 因此根据此发酵条件做三平行三重复追加试验，得到酶活均值为21.84 U/mL，是没优化之前果胶酶活力12.39 U/mL 的1.76 倍。 试验最后对所得数据进行方差分析（表3）比较各因素的显著性，结果显示在试验设计的4 个因素中，只有发酵液蔗糖添加量对产酶影响达到显著水平。

3 结论

缫丝废水可作为微生物发酵的良好材料。 本试验结果表明，沙福芽孢杆菌的最佳产酶条件为：以5%蚕沙为产酶诱导物， 发酵液蔗糖添加量1.1%，接种量16%，发酵液初始pH 9.5，36 ℃发酵84 h。在此优化的发酵条件下，沙福芽孢杆菌果胶酶酶活达到21.84 U/mL。