小肽与酵母培养物对舍饲牦牛瘤胃微生物多样性和发酵参数的影响

黎凌铄， 彭忠利， 陈仕勇， 柏 雪， 苗建军

（西南民族大学畜牧兽医学院，四川成都610041）

瘤胃作为反刍动物特有的消化器官， 其主要特点就是栖居大量的微生物。 由于瘤胃内有很多微生物（细菌、真菌、原虫等）的存在，使得反刍动物能够更好利用高纤维的碳水化合物。 饲料在微生物的作用下， 进行一系列的降解与吸收后所产生的氨、肽、氨基酸等作为氮源，饲料中的有机物发酵所产生的挥发性脂肪酸作为碳架， 腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）作为能量共同合成菌体蛋白，产物可用来维持反刍动物的营养需求。研究表明，小肽是蛋白质的一种存在形式， 能促进氨基酸的吸收、提高蛋白质的沉积、促进矿物质元素的吸收利用效率， 对瘤胃微生物有益菌群有加速繁殖的功效，缩短了细胞分裂周期，并提高微生物蛋白合成能力，增加抗病力（张瑞仙等，2012）。 在瘤胃中小肽可被微生物直接利用合成微生物蛋白（MCP）（王文娟等，2011）。 殷云浩等（2012）报道，饲粮中添加小肽能够促进瘤胃微生物的发酵， 提高挥发性脂肪酸（VFA）含量和MCP 产量，降低NH3-N浓度和乙/丙，提高能量利用率。 李琍（2000）通过检测瘤胃菌群发酵产气量、VFA 和MCP 含量3个主要指标， 得出小肽能提高纤维分解菌的活力和粗纤维的分解。也有研究表明，酵母菌制剂对反刍动物的瘤胃发酵有促进作用， 可改善瘤胃乳头的长度、 宽度， 并使瘤胃壁的厚度得到提高。Chauchey 等（2001）在给无菌羔羊饲喂酵母培养物的试验中得知， 瘤胃内纤维降解菌的定植速度加快，菌群稳定性得到稳固。 Pinloche 等（2013）在动物体内及模拟瘤胃发酵的体外技术中都证实，酵母菌制剂能稳定瘤胃液的pH，降低瘤胃乳酸的浓度。 酵母菌制剂对瘤胃特殊菌群的促进作用使微生物的生长得到加强，发酵效果得到优化，使很多被消化的糖类用于合成MCP， 降低了碳的数量，减少挥发性脂肪酸的生成，瘤胃酸中毒几率降低（仲伟光等，2018）。 牦牛主要分布在高寒地带，而牧草的生长期有限， 冬春季节牧草生长停滞处于枯草和缺草期，这个时期的牧草营养价值较低，蛋白质水平不足， 致使牦牛采食量下降、 体重减轻。 鉴于此， 本试验以低海拔舍饲育肥的方式对牦牛进行饲养， 研究在日粮中添加小肽与酵母培养物对舍饲牦牛瘤胃微生物多样性及发酵参数的影响，为舍饲牦牛育肥的可行性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 时间与地点 试验于2017 年11 月至2018年4 月在四川省阿坝藏族羌族自治州茂县茂欣农牧业发展有限责任公司进行。

1.2 试验动物与饲养管理 试验选取36 头年龄为4 周岁左右、体重水平相当、健康状况良好的麦洼牦牛，随机分为4 个处理组，每个处理组9 个重复，每个重复1 头牛。试验场海拔1450 m，整个试验期内圈舍最高温25 ℃，最低温5 ℃。 试验开始前对圈舍清理消毒， 牦牛进圈后用伊维菌素注射液肌肉注射驱虫，称重分组后按组栓系饲养。预饲期30 d，试验期80 d，每日上午（8：00）和下午（16：00）各饲喂一次，自由采食、饮水。

1.3 试验设计 根据前期大量体外试验结果，综合考虑体外发酵效果、 经济成本以及饲粮配方在牧区的可推广性， 选用精粗比为5：5 的全混合日粮作动物试验。对照组采用基础的全混合日粮，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组在全混合日粮基础上分别添加1%酵母培养物、0.75%小肽和1%酵母培养物+0.75%小肽。 各组日粮组成及营养水平见表1。

表1 日粮组成及营养水平（干物质基础）

1.4 试验材料 试验中所采用的酵母培养物购于美国国际生物营养科技有限公司， 小肽购于成都美溢德生物技术有限公司。

1.5 样品采集及指标检测

1.5.1 瘤胃液采集 采用瘤胃口腔导管法采集瘤胃液（为尽量减少采样误差， 插管由同一人操作），用四层纱布过滤瘤胃液并分装于4 个15 mL离心管和2 个5 mL 冻存管中，15 mL 离心管放于-20°C 保存，用于测定NH3-N、MCP、VFA。 5 mL冻存管放于液氮中保存， 用于测定瘤胃液细菌区系。

1.5.2 检测指标 pH：牦牛屠宰后，立即用四层纱布过滤瘤胃内容物，收集瘤胃液，使用PHB-5型便携式pH 计测定瘤胃液pH。

NH3-N： 参照冯宗慈等 （2010） 的方法进行NH3-N 测定， 取10 mL 瘤胃液4000 r/min 离心10 min， 取1 mL 上清液加1 mL 蒸馏水置15 mL玻璃管内，加入8 mL 0.2 mol/L 盐酸摇匀，取混合液0.4 mL 于玻璃管内，分别加A 液（2 mL）、B 液（2 mL），漩涡振荡摇匀静置10 min，用721 型分光光度计在700 nm 波长进行比色。

VFA：参照曹庆云等（2006）挥发性脂肪酸检测方法。瘤胃微生物细菌DNA 的提取及MiSeq 测序交由上海美吉生物医药科技有限公司进行。

1.6 数据统计分析 试验数据采用Microsoft Excel 进行初步处理，然后用SPSS 24.0 统计分析软件进行单因素方差分析， 用邓肯氏法进行多重比较，结果用“平均值±标准差”表示，P＞0.05 表示差异不显著，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。 瘤胃菌群相关分析数据在上海美吉生物医药科技有限公司I-Sanger 云平台进行。

2 结果与分析

2.1 测序基本数据分析 如表2 所示， 通过MiSeq 测序，20 个瘤胃液样本共获得1134617 条优化序列，每个样本平均产生56731 条，序列平均长度为438.63 bp 左右。

表2 样本测序数据结果

2.2 Alpha 多样性分析 香农指数和辛普森指数可反映瘤胃菌群的多样性，香农指数值越大，群落多样性越高； 辛普森指数值越大， 群落多样性越低。如表3 所示，各组的Alpha 多样性指数无显著差异（P＞0.05），从数值上看，对照组的香农指数高于其他组，辛普森指数则低于其他组，说明对照组的瘤胃菌群比其他组的多样性低； 艾斯指数和赵氏指数可反映瘤胃菌群的丰富度， 各处理组没有出现显著的差异（P＞0.05），从数值上来看，以对照组的丰富度较好，其他组的丰富度逐渐降低，但其差异无统计学意义（P＞0.05）。各组样本覆盖率均在99%以上，说明测序量合理，能够很好地反映瘤胃中微生物的种类和结构。

表3 添加小肽、酵母培养物对舍饲育肥牦牛瘤胃细菌群落Alpha 多样性的影响

2.3 物种组成及差异分析 由图1 可以看出，对照组、试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组牦牛瘤胃中OTUs 总数分别为1381、1267、1326、1240， 对照组独有53 个，Ⅰ组独有26 个，Ⅱ组独有21 个，Ⅲ组独有37 个，四组共同拥有1083 个， 分别占四组OTU 总数的78.42%、85.48%、81.67%、87.34%， 结果表明饲喂小肽和酵母培养物的日粮牦牛瘤胃中OTU 组成有比较好的相似度。

经过序列对比和注释，20 个样本共1687 个OTUs， 从物种分类水平上可分为19 个门、32 个纲、56 个目、97 个科、238 个属、483 个种。 从门水平对添加小肽和酵母的牦牛瘤胃微生物物种组成的相对丰度分析。由表4 可以看出，相对丰度均在1%以上的门有4 个，分别为拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和互养菌门， 其中对照组所占总菌的比例分别为50.72%、43.67%、2.25%、1.24%，Ⅰ组分别为56.52%、34.01%、 1.01%、2.66%，Ⅱ组分别为53.38%、40.14%、 1.02%、 2.30%， Ⅲ组分别为61.29%、33.92%、0.82%、2.86%。 在日粮中添加小肽与酵母培养物对舍饲牦牛瘤胃菌群中的变形菌门、螺旋体门、纤维杆菌门和Saccharibacteria存在显著差异（P＜0.05），其他门之间差异不显著。试验Ⅲ组变形菌门相对丰度显著低于对照组水平，试验Ⅰ和Ⅱ组之间无差异；小肽和酵母培养物的添加提高了螺旋体门、 纤维杆菌门和Saccharibacteria的相对丰度，试验Ⅲ组的相对丰度均显著高于对照组水平。

表4 添加小肽与酵母培养物对舍饲育肥牦牛瘤胃主要细菌丰度的影响（门水平） %

在属水平上选取丰度前20 和具有差异性的菌属做差异分析， 如表5 所示， 各组相对丰度在1%以上且占比在前五的属有普雷沃氏菌属、拟杆菌科的BS11 菌属、理研菌科RC9 菌属、克里斯滕森菌科的R7 菌属、 疣微菌科NK4A214 菌属；其中对照组所占比例分别为17.20%、8.24%、3.53%、2.69%、6.09%； Ⅰ组所占比例分别为22.46%、12.31%、7.23 %、4.40%、3.65%； Ⅱ组所占比例分别为20.75%、9.70%、4.95%、3.59%、5.28%； Ⅲ组所占比例分别为26.18%、14.55%、7.85%、4.41%、3.75%。 在日粮中添加小肽与酵母培养物对舍饲牦牛瘤胃菌群中的理研菌科RC9 菌属、瘤胃球菌2 属、 普雷沃氏菌科UCG-004 菌属、 疣微菌科UCG-010 菌属、帕匹杆菌属、柔膜菌纲的RF9 菌属存在显著的差异（P＜0.05）， 其他菌属间无差异。其中丰度前四的普雷沃氏菌1 属、拟杆菌科的BS11 菌属、理研菌科RC9 菌属、克里斯滕森菌科R7 菌属的相对丰度均随着小肽与酵母培养物的添加而有所提高， 试验Ⅰ组各优势菌属的相对丰度较对照组分别高出30.51%、49.51%、104.80%、63.84%， 试验Ⅱ组分别高出20.57%、17.84%、40.11%、31.73%； 试验Ⅲ组分别高出51.71%、76.58%、122.03%、61.62%，均以试验Ⅲ组相对丰度最高。试验Ⅲ组理研菌科RC9 菌属、普雷沃氏菌科UCG-004 菌属、疣微菌科UCG-010 菌属和帕匹杆菌属、 柔膜菌纲的RF9 菌属的相对丰度显著高于对照组水平，试验Ⅰ和Ⅱ组之间无显著差异，差异属中只有瘤胃球菌属的相对丰度随着小肽与酵母培养物的添加而降低，且差异极显著（P＜0.01）。

表5 添加小肽与酵母培养物对舍饲育肥牦牛瘤胃主要细菌丰度的影响（属水平）%

2.4 小肽与酵母培养物对舍饲牦牛发酵参数的影响 从表6 可以看出， 各试验组舍饲育肥牦牛的NH3-N、乙酸和丁酸均低于对照组水平，但未达到差异显著的水平（P＞0.05），从小到大依次为Ⅲ组＜Ⅰ组＜Ⅱ组，NH3-N 水平较对照组分别降低 了10.49% 、9.6% 、5.02% ， 乙 酸 分 别 降 低15.92%、7.76%、4.15%。 试验Ⅱ组pH 和丙酸值与对照组差异不显著， 试验Ⅰ和Ⅲ组之间差异不显著。 试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组丙酸含量较对照组分别提高了15.89%、4.67%、22.66%； 乙/丙分别降低了20.28%、8.59%、31.33%。

表6 添加小肽与酵母培养物对舍饲育肥牦牛瘤胃发酵的影响

3 讨论

3.1 测序基本数据分析 瘤胃菌群的测序深度是碱基总量与基因组大小的比值， 测序所带来的错误率会随着测序深度及覆盖度的提高而下降；覆盖度即表示所取样品能否真实地反映瘤胃细菌的组成及种类的分布情况， 两者呈正比。 本试验中，20 个瘤胃液样本共获得1134617 条优化序列，每个样本平均产生56731 条，序列平均长度为438.63 bp 左右，与陈芸等（2017）在黑山羊和甄玉国等（2018）在绵羊的试验中所得出的测序深度一致。 同时，本试验20 个瘤胃液样本测序覆盖度均超过了99%，Mao 等（2015）研究表明，覆盖度高于97%时，说明测序样品取样充分。因此，本试验的测序结果能覆盖牦牛瘤胃中大多数细菌群落， 能真实地反映舍饲育肥牦牛瘤胃中细菌的组成情况。

3.2 物种组成分析 在反刍动物的瘤胃中，微生物菌群的组成是判断动物健康与否的重要指标，其群落对动物机体的健康有关键的作用（谢骁2018）。 有研究表明，拟杆菌门和厚壁菌门是反刍动物瘤胃中的优势菌门 （Myer 等，2015；Singh 等，2013；Marcelo 等，2013）。 杨 琦 玥 等（2017） 在牦牛的试验中发现拟杆菌门、 厚壁菌门、变形菌门和螺旋菌门四种优势菌。 本试验所得到的优势菌门分别为拟杆菌门、 厚壁菌门、变形菌门和互养菌门， 和前人研究结论有所差异，可能是由于所选用的牦牛品种、环境条件以及日粮组分不同等所造成的。

甄玉国等（2018）在绵羊的试验中得出，普雷沃氏菌、理研菌科的RC9 菌属、瘤胃球菌、Saccharofermentans为优势菌属。高雨飞等（2016）在分析锦江牛时利用MiSeq 测序技术发现， 优势菌属分别为普雷沃氏菌属、帕拉普氏菌属、理研菌属。 而本研究中，各处理组在属水平的优势菌属为，拟杆菌科的BS11 菌属、理研菌科的RC9 菌属、普雷沃氏菌1 属、疣微菌科NK4A214 菌属、克里斯滕森菌科的R7 菌属，与前人的研究有所不同，推测差异产生的原因是研究对象品种、所选用添加剂、动物个体差异及基础日粮营养成分不同所引起的。Kobayashi（2006）在研究中发现，家养反刍动物瘤胃菌群的丰度不如野生和半家养的反刍动物，可能是由于野生和半家养反刍动物饲料结构及瘤胃菌群较复杂导致的。

3.3 物种差异性分析 从门水平看，添加小肽和酵母培养物显著提高了螺旋菌门和纤维杆菌门的相对丰度，并显著降低了变形菌门的相对丰度，对拟杆菌门和厚壁菌门两种优势菌门无显著影响。甄玉国等（2018）在绵羊的试验中得出，酵母培养物能增加瘤胃中拟杆菌门和纤维杆菌门的相对丰度，并且减少变形菌门的相对丰度。陈芸（2017）在山羊饲喂抗菌肽后发现， 瘤胃细菌区系中厚壁菌门、疣微菌门和无壁菌门的相对丰度显著升高，拟杆菌门有上升的趋势。本试验结果与之相差较大，可能是由于添加剂选择、动物品种及其生理状态、外界环境及日粮组成不同而产生差异。 有研究表明，螺旋菌门能够降解纤维素和半纤维素类物质，对纤维性饲粮成分转化为挥发性脂肪酸产生重要影响（张红涛，2017），拟杆菌门能分解日粮中的糖类和蛋白质类大分子物质， 协助宿主利用机体不能消化的多糖，提高对营养物质的消化吸收效率，增加育肥效果（Tremaroli 等，2012）。

从属水平分析， 添加小肽和酵母培养物显著提高了理研菌科RC9 菌属这一种优势菌属的相对丰度，普雷沃氏菌1 属、拟杆菌科的BS11 菌属和克里斯滕森菌科的R7 菌属的相对丰度均随着小肽与酵母培养物的添加有所提高， 以试验Ⅲ组相对丰度最高， 促进了蛋白质等大分子的消化吸收。 本研究发现，随着小肽和酵母培养物的添加，试验Ⅲ组理研菌科RC9 菌属、 普雷沃氏菌科UCG-004 菌属、疣微菌科UCG-010 菌属、帕匹杆菌属、柔膜菌纲的RF9 菌属的相对丰度显著高于对照组水平，试验Ⅰ和Ⅱ组之间无显著的差异，差异属中只有瘤胃球菌属呈降低的趋势， 且差异极显著（P＜0.01）。

3.4 小肽与酵母培养物对舍饲育肥牦牛发酵参数的影响 pH 作为瘤胃发酵参数中最基本的指标， 是研究瘤胃内环境微生物发酵情况最直接的指标， 对营养物质的消化吸收和瘤胃微生物的生长产生影响，纤维分解菌的适宜pH 为6.1 ～6.9，淀粉分解菌为5.3 ～6.2，原虫为5.6 ～6.9（Cardozo 等，2005）。李莉（2001）在研究中发现，若pH 低于6.2， 瘤胃内的纤维素消化作用将会受到抑制；动物采食后，糖类在瘤胃内进行发酵，产生挥发性脂肪酸的速度加快、 数量也较多， 使得瘤胃中VFA 浓度过高，pH 明显下降造成瘤胃酸中毒（李海燕等，2008）。 Chaucheyras-Durand 等（2010）报道，酵母菌对瘤胃没有影响，甚至有降低瘤胃的作用，这与本试验Ⅰ组结果相一致；本试验Ⅱ组结果与王文娟等（2011） 在绵羊试验中得出结论不一致， 瘤胃灌注大豆小肽对瘤胃液pH 不会造成显著性影响， 可能是选用的动物及日粮配方的差异所造成的。 而Ⅲ组pH 最低，但在正常范围内，说明不会对瘤胃发酵造成显著影响。

瘤胃的氨氮浓度直接关系到蛋白质的降解与合成是否达到平衡， 也是饲料中蛋白质与非蛋白氮在反刍动物瘤胃中的降解产物， 合成菌体蛋白后可直接进入血液循环， 氨氮浓度主要受饲料中蛋白质的溶解度、瘤胃微生物的活性、瘤胃蠕动频率、食糜在瘤胃中的排空速度等指标的影响（栗文钰，2009）。 最适宜瘤胃微生物生长的氨氮浓度为6.3 ～27.5 mg/dL （Preston，1987）， 本试验结果与Arroquy 等（2004）和Wickersham 等（2008）所报道的结果一致，说明瘤胃内NH3-N 浓度能满足瘤胃微生物生长的需要， 这可能是由于所选取的添加剂类型不同使微生物的群体结构发生变化， 从而导致对氮素降解速度和氨氮利用率的不同。

VFA 作为日粮中有机物的发酵产物，是维持动物机体正常生长繁殖的关键因素， 其含量及组成比例是反映瘤胃消化代谢活动的重要指标（高健，2017） 。 朴光赫（2017）发现，添加酵母培养物可增加VFA 产量，降低乙/丙。 闫佰鹏等（2018）研究表明， 酵母培养物对瘤胃VFA 产量无影响，降低了乙/丙，Wang 等（2013）研究表明，小肽能够提高丙酸含量，并显著降低乙/丙。 殷云浩（2012）在体外试验表明， 不同氨基酸组成的小肽随着添加比例的升高，丙酸含量逐渐升高，乙/丙逐渐降低，促进异丁酸和异戊酸的生成，从而改变发酵类型。本试验Ⅰ组与前人结论相一致， 丙酸含量得到显著提高，乙/丙比值显著降低，使得发酵类型逐渐向丙酸型转变；试验Ⅱ组乙/丙与夏楠等（2009）试验结果相近，乙/丙与能量转化效率相关，试验中乙/丙下降，表明丙酸的比例提高，能量的利用效率提高。乙酸是反刍动物乳脂合成的主要前体，丙酸则是反刍动物重要的葡萄糖前体， 可经血液循环到达肝脏，在肝脏内异生成糖元，对动物机体能量的贮存有积极的意义（汪水平，2004）。本试验Ⅲ组的丙酸含量最高，乙/丙值最低，说明小肽和酵母培养物能够共同作用于牦牛的育肥。 小肽与酵母培养物单独添加或同时添加提高了螺旋菌门和拟杆菌门的相对丰度， 进而提高了动物体对纤维素和半纤维素类物质的降解力以及对日粮中的糖类和蛋白质类大分子物质的分解力， 最终达到育肥效果。

4 结论

小肽与酵母培养物单独或同时添加均降低了瘤胃液pH、NH3-N、乙酸和丁酸的浓度，但差异不显著。丙酸含量显著增加，瘤胃发酵类型从乙酸型向丙酸型发酵转变，有利能量利用效率的提高，以1%酵母培养物+0.75%小肽组效果最佳，建议小肽与酵母同时添加。

各处理组之间瘤胃微生物菌群的丰富度、多样性及覆盖度无显著差异。从门水平看，相对丰度1%以上优势菌门有拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和互养菌门， 小肽和酵母培养物的添加增加了拟杆菌门和互养菌门的相对丰度， 并降低了变形菌门的相对丰度；从属水平分析，相对丰度在1%以上且占比前四的优势菌属有普雷沃氏菌、 拟杆菌科的BS11 菌属、 理研菌科的RC9 菌属和克里斯滕森菌科的R7 菌属， 表明小肽和酵母培养物单独或同时添加均能提高优势菌属的相对丰度。