肿瘤微环境中分泌的糖蛋白相关的逆转录相关基因在肝细胞癌发展中的作用研究

唐玉莲,李根亮,倪安妮

(右江民族医学院，广西 百色 533000)

肿瘤微环境(tumor microenvironment, TM)是肿瘤赖以生存的环境，与肿瘤的发生、发展及转移有着密切的关系[1]。肿瘤微环境除了肿瘤基质细胞外，还包括细胞外基质、分泌蛋白、细胞因子和趋化因子等。细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)是肿瘤微环境的重要组成部分，它主要是由成纤维细胞所分泌的蛋白质和多糖所构成的网络结构，包括一些胶原、弹性蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白等。正是由于这些成分赋予了细胞外基质一定的强度、韧性以及抗压能力[2]，形成了细胞赖以生存的环境。肿瘤发生发展过程中，逆转录酶和生长因子等可异常激活，导致细胞发生恶性增殖现象以及形成异常微环境[3]。那么，肿瘤发生发展过程中，细胞外基质发生了何种变化，哪些逆转录相关基因参与构建了异常细胞外基质，细胞外基质中的重要组分-糖蛋白又是如何构建异常细胞外基质参与肝细胞癌发展的？这些问题目前尚有待进一步研究。

目前，虽然有报道在肿瘤发生过程中，肿瘤可驱动细胞外基质重塑，细胞外基质中的各种组分都在发生各种变化[4]。但是，结合逆转录相关基因，对细胞外基质进行综合分析，特别是对糖蛋白相关的逆转录基因在肝细胞癌中可能作用的分析研究未见报道。

因此，本研究以逆转录相关基因(reverse transcription related genes, RTGs)为背景，通过建立小鼠肝癌模型，取成瘤小鼠瘤体组织作为TM，并以癌旁组织作为对照，通过RNA-seq及生物信息学手段，分析TM和对照组织间差异表达的糖蛋白相关RTGs以及它们在癌组织中的作用，探讨其在构建异常细胞外基质参与肝癌发展的可能作用，并通过RT-qPCR验证试验结果，这将有助于进一步理解肿瘤发生、发展及迁移机制，为肿瘤的防治提供一定的思路。

1 材料与方法

1.1H22肝癌小鼠模型建立及样本获取：H22肝癌细胞系购自南京凯基生物技术有限公司。选取鼠龄7周左右，体重22～25 g的健康昆明小鼠100只，体外培养H22肝癌细胞至指数增长期，3 000 r/min离心取细胞，无菌生理盐水洗涤，生理盐水稀释至浓度105个细胞/ml，给予每只小鼠双前肢腋下接种细胞悬液0.2 ml，正常饲养4周后，取TM和癌旁组织。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.2RNA的提取和测序：两种样本组织各取50 μg，使用商品化RNA提取试剂盒提取总RNA。RNA质量检测、逆转录、文库构建及测序数据的处理按常规程序进行。

1.3逆转录相关差异表达基因筛选:通过NCBI中的nucleotide数据库检索Reverse transcript，删除重复项后的检索结果作为比对背景，与测序数据中的差异表达基因比较，筛选出两样本中差异表达的RTGs。

1.4逆转录相关差异表达基因的功能富集分析:采用DAVID 6.8数据库进行功能富集，分析其功能并筛选出糖蛋白相关的RTGs。

1.5RT-qPCR验证逆转录相关差异表达基因的表达情况:随机选取4个逆转录相关差异表达基因进行RT-qPCR，验证其表达量以及RNA-seq测序结果。引物使用Primer-Blast软件进行设计，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.6糖蛋白相关RTGs的编码蛋白的互作网络分析:采用STRING 11.0 数据库对糖蛋白相关RTGs的编码蛋白进行蛋白网络互作分析，分析其分布和功能相关性。

1.7糖蛋白相关RTGs的AS和SNV/INDEL与基因表达的相关性分析:利用Excel软件对糖蛋白相关RTGs中出现的AS和SNV/INDEL进行χ2检验，以P<0.05且两样本间发生频率数≥2的差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1RNA-seq测序分析:提取实验组和对照组样本总RNA送公司测序，分别获得了5.01G base(35.28M clean reads)和5.02G base (35.32M clean reads)的数据。两样本所得clean reads数据与基因组的匹配率分别为93.65%和89.20%，且两样本测序数据的Q20皆大于99%，测序数据质量较高。

2.2逆转录相关差异表达基因筛选和功能富集分析:NCBI检索逆转录相关基因，共检索到28157条逆转录相关基因条目，经DAVID 6.8数据库注释，共在小鼠物种中获得99个RTGs。通过与测序数据比对，共获得了24个差异表达RTGs。其中，上调表达12个，下调表达12个。在TM中，上调表达的12个基因分别为Sh3d21、Cdyl、Tmod3、Loxl2、Col11a1、Traf1、Ehd1、Lox、Fmnl3、G3bp1、Nfkbia、Actn1；下调表达的12个基因分别为Fam155a、Cped1、Abcd2、Prkce、Tmco4、Igsf23、Hand2、Naxd、Il1rn、Slc23a1、Tnfrsf1b、Fas。经功能富集分析，共得到1个BP、1个CC、4个MF和4个UP_SEQ_FEATURE。见图1。

注: BP: 生物学程序; CC: 细胞组分; MF: 分子功能; UP_SEQ_FEATURE: 蛋白位点序列特征图1 差异表达的逆转录相关基因(RTGs)的功能

进一步功能分析，发现Col11a1、Il1rn、Lox、Loxl2、Slc23a1、Abcd2、Fam155a等参与了异常细胞外基质中糖蛋白构建，其中Col11a1、Lox、Loxl2等广泛参与了胶原纤维形成、糖蛋白亚基间二硫键连接、金属离子结合以及细胞外信号转导等。这些基因与Naxd还一同参与了蛋白质糖基化，特别是N-连接糖基化。

2.3逆转录相关差异表达基因的RT-qPCR验证:随机选取4个逆转录相关差异表达基因进行RT-qPCR分析，内参基因为GAPDH，引物序列见表1。数据结果表明，其结果与RNA-seq结果一致。见图2。

2.4糖蛋白相关RTGs的编码蛋白的互作网络分析：对糖蛋白相关RTGs编码蛋白的互作网络关系分析，发现Col11a1、Lox、Loxl2、Il1rn、Prkce、Naxd、Ehd1等编码蛋白的相关性较强。见图3。

表1 RT-qPCR 引物

注: 图中数值为癌旁组织/TM取以5为底的对数值图2 用 RT-qPCR与RNA-seq分析TM和癌旁组织中逆转录相关差异表达基因的表达情况

图3 TM中糖蛋白相关RTGs编码蛋白的互作网络关系

2.5糖蛋白相关RTGs的AS和SNV/INDEL与基因表达的相关性分析：对糖蛋白相关的RTGs的可变剪切事件(AS)、单核苷酸变异(SNV)/插入缺失标记(INDEL)分析，结果显示：均未发现AS，但9个基因发生了82个SNV和4个INDEL位点的改变。9个基因的AS和SNV/INDEL与基因表达的相关性中5个基因的SNV和1个基因的INDEL在两样本中存在统计学差异，且其发生频率与基因表达呈正相关。见表2 。糖蛋白相关的几个主要基因Col11a1、Lox、Loxl2、Prkce、Ehd1均存在SNV和INDEL位点改变。见表3。其中Col11a1发生了1个INDEL和31个SNV；Lox发生了1个INDEL和1个SNV；Loxl2和Prkce均发生了8个SNV；Ehd1发生了2个SNV，这些基因位点的改变主要发生在基因的3个部位，即外显子区(exonic)、内含子区(intronic)和基因间区(intergenic)。

3 讨论

实体肿瘤的发生发展常伴随着细胞外基质的过量沉积及其组织形式的异常[5]。细胞外基质蛋白的结构与功能受糖基化、共价交联等翻译后修饰的调控，且细胞外基质网络结构与功能的紊乱将导致癌症、组织纤维化、结缔组织异常等多种疾病的发生[6]。通过研究，发现在TM中异常表达多个逆转录相关基因，它们的分子生物学过程主要集中在肿瘤异常微环境细胞外基质的构建方面(如胶原纤维组织、糖蛋白、细胞外基质等)。尤其值得一提的是，存在大量糖蛋白参与这一生物学过程。糖蛋白是细胞外基质的重要组成成分，包括不溶性大分子的结构糖蛋白和各种非结构性糖蛋白。肿瘤细胞外基质与正常组织实质相比，含有更多的胶原蛋白[7]，而糖蛋白的异常糖基化则与肝癌密切相关[8]。由此可见，糖蛋白参与了肿瘤的发生、发展过程。

表2 SNV/INDEL发生频率与基因表达的相关性

表3 TM中主要几个糖蛋白相关RTGs的SNV/INDEL发生情况

笔者在TM中发现大量糖蛋白相关的RTGs差异表达，这说明糖蛋白对肿瘤的发生、发展可能有很大影响。蛋白位点序列特征分析表明，有8个差异表达的糖蛋白相关RTGs，即Col11a1、Il1rn、Lox、Loxl2、Slc23a1、Abcd2、Fam155a和naxd，它们都含有糖蛋白N-连接型糖链(简称N-糖链)的糖基化位点，其中两个还具有类赖氨酰氧化酶感兴趣区域、赖氨酸酪氨酸醌交联区及铜离子结合位点等活性连接区。结合此前的一些报道，糖基化位点与糖基化水平异常与肿瘤的发生、发展密切相关[9-10]。这说明，TM中异常表达的糖蛋白可能主要通过N-粘连、N-乙酰葡糖胺的糖基化、赖氨酸酪氨酸醌的交叉粘连、金属离子结合以及类赖氨酰氧化酶结合等形式构建异常的胞外基质。另差异表达基因的4个MF则表明，差异表达的糖蛋白还可能通过蛋白质赖氨酸6-氧化酶活性、氧化还原酶活性、作用于供体的CH-NH2、氧作为受体、ATP结合、甲基化组蛋白结合等参与肝细胞癌的发生、发展。赖氨酸6-氧化酶起胺氧化酶的作用，在细胞外基质的调制过程中修饰赖氨酸残基促进胶原和蛋白交联[11]；氧化还原酶通过调节氧化还原稳态和细胞外基质微小而渐进的变化具有促进纤维化作用等[12]。

笔者的研究表明，在肝癌组织中Col11a1、Lox、Loxl2等上调表达，Slc23a1、Abcd2、Fam155a、Prkce、Il1rn以及naxd等下调表达。其中，上调表达的Col11a1，能够通过控制Ⅱ型胶原纤维的横向生长而在纤维发生中起重要作用，并通过编码Ⅱ型胶原蛋白参与肿瘤的发生、发展。此外，Col11a1还可活化间质干细胞成为癌相关成纤维细胞，从而导致肿瘤生长和预后不良[13]。上调表达的细胞外铜依赖性胺氧化酶Lox (赖氨酰氧化酶)及Loxl2(赖氨酰氧化酶样蛋白2)，在细胞外基质中不仅可以将赖氨酸残基氧化脱氨基从而介导纤维胶原和弹性蛋白交联，维持细胞外基质结构[14-15]，还可作为血管生成的调节因子，介导Ⅳ型胶原支架形成，从而发挥调节血管生成、营养肿瘤细胞的作用。

另外，笔者通过AS和SNV/INDEL分析，发现这些糖蛋白相关RTGs在肿瘤组织中异常表达与它们的基因多态性相关，有9个基因发生了82个SNV和4个INDEL位点的改变，且具有统计学意义的SNV和INDEL的发生频率与相应基因的表达呈正相关。这些基因位点的改变主要发生在参与转录调控的重要区域，如外显子区、内含子区或基因间区。这表明，SNV和INDEL引进的基因多态性在肝癌中扮演着调控基因表达的重要角色。

综上所述，本研究通过RNA-seq及生物信息学手段阐释了肿瘤发生、发展过程中细胞外基质的改变，并进一步阐述了细胞外基质中的重要组分-糖蛋白相关差异表达基因在构建异常细胞外基质参与肝癌发生、发展中的作用，对进一步理解肿瘤发生、发展及迁移机制具有重要的意义。

致谢

本研究由广西自然科学基金(2016GXNSFAA380177和2015GXNSFAA139219)、广西研究生教育创新计划项目(NO:JGY2020164)共同资助。