PoprL启动子对丁香假单胞菌DC3000合成冠菌素的影响

何彦, 姜峰, 于莎, 于春欣, 谭伟明, 李召虎, 张杰, 段留生*

(1.中国农业大学农学院， 植物生理生化国家重点实验室， 教育部植物生长调节剂工程研究中心， 北京 100193； 2.中国农业大学园艺学院， 北京 100193；3.中国农业科学院植物保护研究所， 植物病虫害生物学国家重点实验室， 北京 100193)

冠菌素(coronatine，COR)是由丁香假单胞菌等几个致病变种产生的次生代谢产物，是一种具有生物活性的天然化合物[1]。COR化学结构由冠菌酸(coronafacic acid, CFA)和冠烷酸(coronamic acid, CMA)两部分组成[2]。在丁香假单胞菌DC3000中，生物合成CMA和CFA是独立的：CMA的生物合成来源于L-异亮氨酸，由CmaA的非核糖体肽合成酶腺苷酸结构域激活；CFA由环戊酮化合物合成，随后由CFA操纵子基因进行修饰；冠状连接酶cfl是CFA操纵子内九个开放阅读框之一，它以酰胺键连接CFA和CMA，形成COR[3-4]。研究表明，COR广泛参与植物的生理和生化过程，包括乙烯释放、花青素产生、生长素合成和生物碱积累[5-8]。低浓度COR可以增强植物的抗逆性，包括棉花耐盐性[9]、大豆和花椰菜抗旱性[10-11]、小麦热逆性[12]和黄瓜耐冷性[13]。由于能够调节植物生长、发育和对胁迫的反应，COR及其衍生物被认为是农业化学应用中有潜力的目标化合物，包括开发新型除草剂[14-15]。

启动子在基因的转录和表达调控中具有极其重要的作用，是核酸序列分子上RNA聚合酶和转录调节因子等识别并结合从而形成转录起始复合物的区域。目前，常见的启动子转录模式为3种：组成型表达启动子、组织/器官特异性表达启动子和诱导型表达启动子[16]。组成型启动子在不同的培养条件下强弱稳定；诱导型启动子则在特定的培养条件下启动基因表达[17]。在代谢工程中，常常需要表达外源基因或者调控内源基因表达来影响代谢产物的合成，因此启动子的选择对基因的表达调控至关重要，它能够影响基因的转录水平，影响人工合成途径或本源途径中各基因间的协调性，继而影响菌株的代谢功能和产物[18]。

研究表明，利用高效表达型启动子可以提高微生物中代谢产物的产量。王欣然[19]在链霉菌中利用高效启动子5063p与格尔登素PKS启动子置换，对PKS基因进行定向过表达，发酵代谢产物格尔登素的产量提高了39%。在菌株M.echinosporaz中启动子PermE*通过同源重组替换，表达具有催化庆大霉素合成功能的基因kanJ和kanK，代谢产物庆大霉素的产量由85 μg·mL-1提高到了342 μg·mL-1[20]。在酿酒酵母中，通过启动子改造等方法，得到了不同程度产D-乳酸的工程菌株，最高产量达到了5.8 g·L-1[21]。在冠菌素异源表达菌株PseudomonasputidaKT2440中，采用依赖于σ70的组成型启动子PrpsH替换原始启动子可使冠菌素合成的前体物质冠菌酸(CFA)产量提高10倍[22]。cfl基因在DC3000中的转录活性远远低于PG4180，相对应的冠菌素产量在PG4180中更高，在PG4180中冠菌素产量是DC3000冠菌素产量的25～40倍。此外，cfl的转录水平也受温度的影响，在18 ℃时的转录活性高于28 ℃时的转录活性。这些结果表明，cfl基因启动子的活性会影响冠菌素的生物合成[23-24]。

启动子PoprL来自于恶臭假单胞菌肽聚糖相关脂蛋白(peptidoglycan-associated lipoprotein)编码基因oprL，研究表明，oprL基因启动子-35区和-10区很保守，与σ70识别的启动子具有很高的相似性，用该启动子在大肠杆菌中表达β-半乳糖苷酶，表达效率很高[25]。为了提高丁香假单胞菌DC3000冠菌素产量，改善高温发酵培养条件对菌株冠菌素产量的制约影响，本研究将高效表达组成型启动子PoprL同源重组到丁香假单胞菌DC3000冠菌素合成基因cfl中，研究启动子PoprL对冠菌素生物合成产量和发酵培养条件的影响，所得研究结果不仅为冠菌素高产工程菌的构建和发酵条件的优化提供新的思路和参考，而且也为冠菌素的工业化生产应用提供更多的选择和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1菌株和质粒 研究中出发菌株为丁香假单胞菌番茄致病变种Pseudomonassyingaepv.tomatoDC3000，该菌株为产COR野生型菌株，具有Amp和Rif抗性；菌株PseudomonasputidaAB92019，含PoprL启动子野生型菌株，具有Cb抗性；质粒pUCP24/recTE，含有recTE基因重组质粒载体，具有Gen抗性；质粒pKD4，含卡那抗性基因载体，均由本实验室保存。

1.1.2培养基 菌株培养基为LB培养基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，用蒸馏水溶解后定容至1.0 L，并调节pH 7.2左右。

种子液培养基为MG培养基：甘露醇10.0 g，L-谷氨酸钠2.0 g，KH2PO40.5 g， NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，用蒸馏水溶解后定容至1.0 L，调节pH至7.0。

发酵培养基：NH4Cl 1.0 g、K2HPO43.6 g、KH2PO44.1 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、KNO30.3 g，用890 mL蒸馏水溶解后调节pH至6.8，121 ℃灭菌30 min，接种前加入单独灭菌的2 mmol·L-1FeCl310 mL，过滤除菌的20%(质量体积分数)葡萄糖溶液100 mL。

菌株转化子的筛选和重组菌株的培养所使用抗生素的终浓度为：卡那霉素(Kanamycin, Kan)50 μg·mL-1；庆大霉素(Gentamicin, Gen)10 μg·mL-1。

固体培养基的配制为在上述培养基中加入1.5%(质量体积分数)的琼脂粉。

拟南芥种子培养基：1/2 MS培养基、0.8%(质量体积分数)琼脂粉、1%(质量体积分数)蔗糖，pH 5.8～6.0，灭菌备用。

1.1.3主要试剂 PCR所用试剂、DNA Marker均购自大连TaKaRa公司，PCR引物由上海生工生物工程公司合成，细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)和质粒提取试剂盒均购自天根生化科技有限公司(北京)。RNA提取试剂盒和RT-qPCR试剂盒均购于康为世纪公司。冠菌素标准品购自Sigma 试剂公司(美国)，色谱甲醇购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，石油醚、乙酸乙酯均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1启动子重组菌株的构建 挑取菌株PseudomonasputidaAB92019和PstDC3000单菌落于LB培养基，28 ℃，180 r·min-1摇床培养12 h以上，利用天根细菌基因组试剂盒提取PseudomonasputidaAB92019和丁香假单胞菌PstDC3000 总DNA。利用同源重组方法[26]构建重组菌株，以叶婷[27]报道的PoprL启动子引物序列，并结合NCBI上PstDC3000基因组序列信息设计SOE-PCR融合基因引物(表1)。以PseudomonasputidaAB92019基因组DNA为模板，引物CO1/CO2扩增PoprL启动子片段，反应程序为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，56 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸30 s，30个循环。回收362 bp目的片段；以pKD4质粒为模板，引物CO3/CO4扩增卡那抗性基因，反应程序中PCR退火温度57 ℃ 45 s，延伸时间1 min，30个循环，回收795 bp目的片段。采用SOE-PCR方法进行PoprL启动子片段与卡那基因融合，PCR扩增分为两步：第一步将上述回收的两个目的片段既为模板又为引物进行PCR扩增，退火温度58 ℃ 3 min，延伸时间90 s，13个循环；再以此次PCR产物为模板，引物CO1/CO4进行第二步PCR扩增，退火温度58℃ 45 s，延伸时间90 s，30个循环，回收得到1 157 bp融合片段。按照上述同样的方法进行cfl基因启动子上游同源臂片段532 bp(引物CO5/CO6)和cfl基因启动子下游同源臂片段532 bp(引物CO7/CO8)扩增与融合，最终回收得到 2 221 bp融合目的片段。将质粒pUCP24/recTE电击转化到PstDC3000感受态中。转化条件：脉冲场强V为12.5 kV·cm-1, 电容C为25 μF，阻抗R为200 Ω，脉冲时间G为4 ms。Gen抗性筛选转化子得到含有pUCP24/recTE重组质粒的PstDC3000菌株，再将回收得到的2 221 bp融合目的片段电击转化到含有pUCP24/recTE重组质粒的DC3000菌株中，Kan抗性筛选转化子，PCR扩增鉴定，擎科公司测序验证。

1.2.2冠菌素的提取和检测 出发菌株PstDC3000与重组菌株MG固体培养基平板划线，培养箱28 ℃培养。挑选出发菌株PstDC3000与重组菌株单菌落至MG液体培养基，培养至种子液OD600达到1.0，将种子液接种至发酵培养基中，接种量为2%(体积分数)，分别于18和28 ℃，180 r·min-1摇床培养10 d取样。取1.5 mL发酵液于2 mL离心管中，调节pH 至2.5～2.9，8 000 r·min-1离心10 min，取上清1.0 mL于新离心管中，加入1.0 mL石油醚，震荡20 s 后，静置2 min，移除上层有机相后加入1.0 mL乙酸乙酯，震荡萃取20 s后静置2 min，将乙酸乙酯相转移至新离心管中，重复萃取3次，自然风干或氮气吹干后溶于1.0 mL 甲醇即为待测样品，用于冠菌素含量检测[28]。冠菌素含量采用高效液相色谱法测定，高效液相色谱流动相由甲醇和水(含0.5%的乙酸)按6.5∶3.5比例配成，检测波长为220 nm，流动速度为1 mL·min-1，进样量为20 μL，样品保留时间为30 min，并通过与冠菌素标准品峰面积比较确定冠菌素的含量。

1.2.3致病性检测 选取同一生长时期的拟南芥野生型Col-0分别接种PstDC3000和基因重组菌(菌液OD600≈0.01)，22 ℃、16 h光照培养，19 ℃、8 h 黑暗培养。使用1 mL去针头的注射器从拟南芥叶片背面分别注入PstDC3000和基因重组菌菌液，同时将注射等量MgCl2溶液的拟南芥叶片作为对照，72 h后观察发病情况。

1.2.4RNA提取和qRT-PCR实验PstDC3000和基因重组菌分别接入发酵培养基，分别于18 和28 ℃，180 r·min-1摇床培养24和 48 h后收集菌体，按照康为世纪 RNA pure Bacteria Kit说明书提取RNA，用Takara公司试剂 DNaseⅠ消化处理，并按照Takara PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit说明书进行cDNA合成，用SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)试剂进行qRT-PCR试验，所用引物见表1。反应体系为15 μL：SYBR©Premix ExTaqTM II(2×)7.5 μL，PCR Forward Primer(10 μmol·L-1)0.3 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol·L-1)0.3 μL，ROX Reference Dye II(50×)0.3 μL，稀释10 倍的cDNA 模板1.5 μL，ddH2O 5.1 μL。反应程序：95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40 个循环； 95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。

2 结果与分析

2.1 启动子基因重组菌株的获得

以PseudomonasputidaAB92019总DNA为模板，用引物CO1和CO2进行PCR扩增，获得大小为362 bp的 PoprL启动子片段。基于基因同源重组原理对cfl基因启动子区域进行替换，筛选到具有卡那霉素抗性的突变菌株，利用cfl基因启动子上、下游同源臂两端位置引物CO5和CO8，对突变菌株目的片段进行PCR扩增验证，预期扩增片段大小为2 221 bp，将目的条带回收测序，基因序列正确，说明成功构建了含有PoprL启动子的重组菌株，命名为CO。

2.2 基因重组菌株生长及其冠菌素产量情况

将基因重组菌株CO和出发菌株PstDC3000进行发酵培养，对18 和28 ℃培养过程中菌株生物量(OD600)、发酵液pH以及发酵10 d后冠菌素产量进行检测。由菌株的生长曲线(图1)可以看出，在发酵培养1～2 d时，重组菌株CO的生长速度在28 ℃培养条件下明显高于出发菌株，能较快达到稳定期，在18 ℃培养条件下与出发菌株相比没有明显差异，表明PoprL启动子在28 ℃培养条件下有促进PstDC3000菌体生长的作用。

图1 重组菌株CO和出发菌株DC3000的生长曲线Fig.1 Growth curve of recombination strain CO and original strain DC3000

从发酵液pH(图2)来看，重组菌株CO与出发菌株相比，在18 ℃培养条件下差异明显，出发菌株发酵液pH出现下降时间较早，而CO菌株发酵液pH下降缓慢且持续下降，在28 ℃培养条件下二者基本无差别。

图2 重组菌株CO和出发菌株DC3000培养中pH变化情况Fig.2 Culture pH change of recombination strain CO and original strain DC3000

采用HPLC检测发酵液中的冠菌素含量(图3)，在18 ℃培养条件下，重组菌株CO冠菌素产量为15.21 mg·L-1，是出发菌株的1.8倍；在28 ℃培养条件下，重组菌株CO冠菌素产量为14.81 mg·L-1，是出发菌株冠菌素产量的4.1倍，由此可以看出，PoprL启动子能够促进丁香假单胞菌中冠菌素的生物合成表达。此外，在两个不同培养温度下，出发菌株冠菌素产量差异明显，在18 ℃发酵条件下的冠菌素产量是28 ℃发酵条件下的2.4倍，表明出发菌株在高温发酵条件下，冠菌素产量受到了明显的抑制；而启动子PoprL重组菌株CO在两个温度发酵培养条件下产量没有明显差异。从而表明启动子PoprL能够改善高温对冠菌素产量的抑制作用。

图3 重组菌株CO和出发菌株DC3000冠菌素产量Fig.3 Coronatine yield of recombination strain CO and original strain DC3000

2.3 基因重组菌株CO冠菌素合成调控相关基因qRT-PCR的检测

将重组菌株和出发菌株在发酵培养基中进行培养，于接种24 h和48 h时取样，采用qRT-PCR检测了菌株冠菌素合成过程中连接酶基因cfl、冠菌酸合成酶基因cfa1、冠烷酸合成酶基因cmaA和调控相关基因编码合成组氨酸激酶基因corS、RNA聚合酶σ54因子rpoN、RNA聚合酶σ因子hrpL的相对表达量，以出发菌株DC3000表达量为参照。从图4中可以看到，冠菌素合成基因cfl和基因cfa1表达量在24 h变化较小，在培养48 h时出现了明显的上调，并且cfl在28 ℃发酵条件下表达量上调程度高于18 ℃，而cmaA基因表达量在重组菌组CO中受到了抑制，在检测样品中表达量出现下调；冠菌素调控基因corS表达量在检测样品中都有上调现象，rpoN表达量在28 ℃时有明显上调，hrpL表达量在28 ℃、48 h上调。这些结果表明启动子PoprL对基因cfl和cfa1有明显的增强表达作用，对冠菌素合成调控基因表达促进作用相对较小，在基因水平上验证了启动子PoprL对冠菌素生物合成的促进作用。

2.4 重组菌株COR致病性检测

COR处理的叶片组织中观察到的主要症状是强烈的广泛性黄化，这种现象可以在多种植物上诱导产生[29]。为了鉴定启动子重组菌株中COR生理活性，对菌株CO致病性进行检测。将出发菌株和启动子重组菌株CO分别注射接种拟南芥野生型Col-0，72 h后观察两株菌株的致病性，结果(图5)表明，注射 MgCl2对照的叶片并没有出现萎黄现象；在接种野生型PstDC3000的拟南芥叶片中出现了明显的萎黄现象；接种启动子重组菌株CO的叶片中也出现了明显的萎黄现象。这些结果进一步表明，在出发菌株启动子替换之后，PoprL启动子能够成功启动冠菌素生物合成基因的表达。

图4 重组菌株CO冠菌素合成调控相关基因qRT-PCR检测Fig.4 qRT-PCR detection of coronatine synthesis and regulator genes in recombination strain CO

3 讨论

目前，COR主要以微生物菌株发酵的方式获得，在Pseudomonassyringaepv.glycinea4180发酵生产中，COR产量最佳温度为18 ℃，而菌株培养最佳温度为28 ℃;在低温下进行菌株冠菌素生产，会导致其发酵周期较长，且消耗大量的能源，极大地加大了工业生产成本，因此温度在一定程度上制约了COR发酵生产效率，从而限制了冠菌素的工业化生产及应用[30-31]。焦睿等[32]通过Tn5随机诱变方法从874个突变株中筛选到2株28 ℃下产冠菌素菌株MFB132和MFB141，与出发菌株相比产量分别提高了19和21倍，但是插入位点和作用机制不明，推测其插入位点为温度调控冠菌素生物合成的相关基因。Tn5随机诱变由于插入位点不确定性，大大增加了菌株筛选工作量，且筛选效率相对较低。本研究通过定向的对启动子基因进行重组改造，作用位点明确，所用方法便于筛选，并可以利用现有菌株资源构建高产菌株以及开展机制研究。此外,COR生物合成中冠状连接酶基因cfl的转录受温度影响，在18 ℃的转录活性高于28 ℃。分析cfl基因启动子序列以及体外实验验证，发现COR合成前体CMA中cmaA基因和COR合成调控基因corS同样受到温度调控，且这些基因的启动子中存在受温度调节的转录激活因子corR蛋白结合位点[24]。这些结果说明，温度对启动子活性的调控作用影响了菌株中COR的生物合成表达，并且影响了COR最适产量温度。因此，要想获得高温型产冠菌素菌株，应从COR生物合成中受温度调控的基因和启动子及其转录活性因子等方面开展工作。

A：Col-0注射MgCl2，CK；B：Col-0注射出发菌株DC3000；C：Col-0注射重组菌株COA: Col-0 injected with MgCl2, CK; B: Col-0 injected with DC3000; C: Col-0injected with CO图5 出发菌株DC3000和基因重组菌株CO致病性检测Fig.5 Symptom on Arabidopsis wild-type col-0 inoculated with DC3000 and CO

用PoprL启动子来表达恶臭假单胞菌 YMB001中gfp基因，分别于16、20、24、28和37 ℃下培养，对GFP表达量进行检测，发现温度对PoprL启动子活性基本没有影响[27]。本研究表明,PoprL启动子重组菌株在18和28 ℃发酵培养条件下都能提高冠菌素的产量，对冠菌素生物合成表达具有促进作用，并且启动子重组菌株28 ℃发酵条件下COR产量与18 ℃产量接近，表明温度对其影响较小，而且在重组菌株中COR合成基因cfl和cfa1表达量明显上调。因此，可以推测PoprL启动子中可能不存在受温度调节转录活性因子蛋白结合位点，而可能存在其他一些能够调控COR合成的蛋白结合位点，这些需要我们进一步进行研究验证。

冠菌素是一种具有开发前景的新型植物调节剂，在常温下利用丁香假单胞菌发酵生产冠菌素的报道很少。本研究通过启动子同源重组替换，成功构建了启动子重组菌株CO，在18 ℃发酵培养条件下，冠菌素产量是出发菌株1.8倍，达到了15.21 mg·L-1，在28 ℃培养条件下，冠菌素产量是出发菌株4.1倍，达到了14.81 mg·L-1，有效地改变了高温下冠菌素产量低的现象。本研究工作不足之处在于重组菌株的产量还不足以用于规模化生产应用，还需进一步深化改造来提高冠菌素产量，因此, 本研究中得到的重组菌株可为进一步构建冠菌素高温高产菌株提供理论基础，为开展冠菌素生物合成调控机理研究，为设计更有效的COR生物合成工程菌株和发酵生产工艺开辟新的思路和可能性。