人参多糖提取工艺优化及体外抗氧化作用的研究

葛俊宏，许梦然，王迦琦，高婧雯，侯俊宇，李明慧，李 坦，，申 野，，孙 新，

(1.北华大学药学院，吉林 吉林 132013；2.吉林省分子老年医学重点实验室，吉林 吉林 132013； 3.北华大学基础医学院，吉林 吉林 132013)

人参为多年生草本植物，具有天然的食用及药用价值，在《本草纲目》《神农本草经》中均有记载[1-2].人参中包含皂苷、糖类、氨基酸、维生素、多肽、有机酸等多种化学成分，其中人参多糖(Ginseng Polys- accharide)作为其主要活性成分，发挥着重要的药效活性作用[3-5].20世纪60年代，SOLOV’EVA等[6]从人参根中分离出了果胶，发现其主要是由多糖组成，又有研究[7]发现人参多糖在抗氧化方面作用显著.人参多糖的提取方法常用的有超声辅助法、水提醇沉法等.超声辅助法容易使植物组织破壁或变形，从而导致多糖活性成分减少[8]；水提醇沉法操作简单、安全，不易破坏多糖的活性成分[9].因此，本研究在单因素试验的基础上，通过正交分解法优化人参多糖提取工艺，并利用FRAP法、DPPH法及羟自由基法测定人参多糖的体外抗氧化活性[10]，为人参多糖的进一步开发利用提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 材 料

人参的干燥根及根茎(长白山特色植物种植基地)；水溶性维生素 E(Sigma 公司，美国)；乙醇(天津市大茂化学试剂厂)；氯仿(天津凯信化学工业有限公司)；正丁醇(国药集团化学试剂有限公司)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，Sigma公司，美国)；FRAP总抗氧化能力检测试剂盒(碧云天生物科技有限公司)；羟自由基试剂盒(南京建成生物科技有限公司).

1.2 仪器与设备

Infinite M200 PRO酶标仪(Beckman，美国)；EZ台式冻干机(SIM公司，美国)；KQ-250E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TDL-5-R低速离心机(上海安亭科学仪器厂)；MDF-U4086S -80 ℃超低温冰箱(SANYO公司，日本).

1.3 试验方法

1.3.1 人参多糖的提取流程

称取适量的人参，在适当的提取温度、提取时间、料液比、提取次数的条件下，加适量的蒸馏水浸泡、煎煮，浓缩至一定体积后，缓慢加入4倍量的95%乙醇，常温静置4 h，3 800 r/min离心；弃去上清液，沉淀物依次用95%乙醇、无水乙醇及乙醚梯度洗脱，真空干燥后得到人参粗多糖.将人参粗多糖水溶液置于-80 ℃冰箱静置过夜，次日取出室温溶解，12 000 r/min离心[11]，收集上清，反复冻融至无沉淀产生.按V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1配置Sevage工作液，取上述多糖溶液与Sevage工作液按1∶4混合，使用振荡器震荡1 h，4 000 r/min离心，取上清，重复Sevage过程，直至没有变性蛋白出现.把多糖溶液转入3 500 Da[12-13]的透析袋中，置于流水下24 h，最后将透析后的多糖溶液置于冻干机中冻干，即得到人参多糖.多糖得率的计算公式：

多糖得率=m多糖/m人参×100%，

式中：m多糖为提取出的人参多糖的质量(g)；m人参为人参原材料质量(g).

1.3.2 单因素试验

单因素试验分别选取提取温度、料液比、提取时间和提取次数作为因素变量，按照上述多糖的提取工艺，探讨4个因素3个水平对多糖得率的影响.

1)不同提取温度对人参多糖得率的影响：在料液比m(g)∶V(mL)=1∶30、提取次数2次、提取时间60 min时，设定不同的提取温度(30、40、50、60、70、80 ℃)，考察提取温度对人参多糖得率的影响.

2)不同料液比对人参多糖得率的影响：提取温度60 ℃、提取次数2次、提取时间60 min时，设定不同的料液比[m(g)∶V(mL)=1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60]，考察料液比对人参多糖得率的影响.

3)不同提取时间对人参多糖得率的影响：在提取温度60 ℃、料液比m(g)∶V(mL)=1∶30、提取次数2次时，设定不同的提取时间(20、30、40、50、60、70 min)，考察提取时间对人参多糖得率的影响.

4)不同提取次数对人参多糖得率的影响：在提取温度60 ℃、料液比m(g)∶V(mL)=1∶30、提取时间60 min时，设定不同的提取次数(1、2、3、4次)，考察提取次数对人参多糖得率的影响.

1.3.3 正交设计试验

单因素试验初步确定提取参数变量范围后，以此试验结果为基础，进行4因素3水平L9(34)正交试验，见表1.

表1 因素水平L9(34)

1.4 人参多糖的体外抗氧化活性

1.4.1 人参多糖对FRAP的总抗氧化能力

使用TPTZ稀释液、TPTZ溶液和检测缓冲液配置FRAP工作液.称取27.8 mg的FeSO4·7H2O，溶解并定容到1 mL，此时浓度为100 mmol/L.取100 mmol/L FeSO4溶液稀释至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/L，向96孔板内每孔加入180 μL FRAP工作液和5 μL不同浓度FeSO4溶液，做标准曲线.将人参多糖和水溶性维生素E分别稀释至不同浓度(25～800 μg/mL)，设置空白组和试验组.空白组：向96孔板内加180 μL FRAP工作液和5 μL蒸馏水；试验组：向96孔板内每孔加入180 μL FRAP工作液和5 μL不同浓度的人参多糖或水溶性维生素E.37 ℃孵育5 min后，在593 nm处测定其吸光度值.根据标准曲线检测水溶性维生素E和人参多糖的总抗氧化能力[14].

1.4.2 人参多糖对DPPH自由基的清除能力

配置(25～800 μg/mL)不同浓度的水溶性维生素E和人参多糖，取无水乙醇和DPPH 粉末配制 2×10-4mol/L的DPPH 溶液.设置空白组、对照组和试验组.空白组：向96孔内加100 μL蒸馏水和100 μL DPPH溶液.对照组：向96孔板内加100 μL不同浓度的人参多糖或水溶性维生素E，每孔再加入100 μL蒸馏水；试验组：向96孔板内加100 μL不同浓度的人参多糖或水溶性维生素E，每孔再加入100 μL DPPH溶液.震荡混匀，静置30 min，测其在510 nm处的吸光度值.根据下式计算人参多糖和水溶性维生素E的清除率[15]：

清除率=[A0-(A1-A2)]/A0×100%，

式中：A0为DPPH加水测得的吸光度；A1为不同浓度的多糖或水溶性维生素E加DPPH测得的吸光度；A2为水的吸光度.

1.4.3 人参多糖对羟自由基的清除能力

配置1～6 mg/mL不同浓度的水溶性维生素E和人参多糖，再依次配置浓度为6 mmol/L的硫酸亚铁、水杨酸和过氧化氢溶液.设置空白组、对照组和试验组.空白组：向96孔板中加入50 μL蒸馏水，再加入50 μL硫酸亚铁、50 μL水杨酸及50 μL过氧化氢；对照组：向96孔板中加入 50 μL不同浓度人参多糖或水溶性维生素E，每孔再分别加入50 μL硫酸亚铁、50 μL蒸馏水及50 μL过氧化氢；试验组：向96孔板中加入50 μL不同浓度的人参多糖或水溶性维生素E，每孔再分别加入50 μL 硫酸亚铁、50 μL水杨酸以及50 μL过氧化氢.摇匀，静置30 min，测其在510 nm处吸光度值.根据下式计算人参多糖和维生素E的清除率[16]：

清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%，

式中：A0为空白组的吸光度；A1为试验组的吸光度；A2为对照组的吸光度.

1.5 统计学分析

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取温度

提取温度选择30～80 ℃，随着提取温度的升高，多糖得率也随之升高，当温度升高至60 ℃时，多糖得率达到(9.73±0.46)%；但当温度超过60 ℃时，多糖得率却出现了下降的趋势.由于温度对分子运动的速度有所影响，在一定温度范围内，随着温度的升高，分子运动速度加快，多糖更容易浸出，而过高的温度会破坏多糖的结构，导致多糖含量降低[17].因此，人参多糖提取温度选择在50～70 ℃进行正交试验.见图1.

2.1.2 料液比

料液比选择m(g)∶V(mL)=1∶10～1∶60，随着料液比的升高，多糖得率也随之升高，当料液比升高到30 g/mL时，多糖得率达到(8.95±0.15)%；但当料液比超过30 g/mL时，多糖得率却出现了下降的趋势.由于随着液体比例的增加，影响了溶剂间的热传递，不利于多糖的浸出，而过低的料液比使溶液黏度大，活性成分不易扩散，导致得率低[18].因此，料液比m(g)∶V(mL)选择1∶20～1∶40 进行正交试验.见图2.

图1提取温度对人参多糖得率的影响Fig.1Effect of extraction temperature on the yieldof Ginseng polysaccharides图2料液比对人参多糖得率的影响Fig.2Effect of material-liquid ration on the yieldof Ginseng polysaccharides

2.1.3 提取时间

提取时间选择20～70 min，随着提取时间的增加，多糖得率也随之升高，当提取时间为60 min时，多糖得率达到(8.81±0.19)%；但当提取时间超过60 min时，多糖得率却出现了下降的趋势.由于提取时间较短时，多糖还没有得到浸出，而在一定时间范围内，多糖得率会随着时间的增加而升高，但超出该范围时，其他成分会溶出过多，多糖也会因过度水解导致得率下降，从而影响多糖的浸出[19].因此，提取时间选择40～60 min进行正交试验.见图3.

2.1.4 提取次数

提取次数选择1～4次，提取次数的多少对多糖得率有较大的影响，当提取次数为2次时，多糖得率达到(8.76±0.10)%；但随着提取次数的增加，多糖得率略有下降并趋于平衡，多糖无法进一步溶解，增加提取次数对多糖得率已无明显影响.因此，提取次数选择2～4次进行正交试验.见图4.

2.2 正交试验

根据图1～ 4单因素试验得到单因素下多糖得率的最佳提取条件，再考虑单因素中的几个主要影响因素对多糖提取的影响，设计正交试验优化工艺中的最佳提取条件，将最佳提取条件所得多糖得率与其他提取方案所得多糖得率进行统计学分析.正交优化试验结果表明：影响人参多糖得率的因素大小依次为提取温度(B，R=0.763)>料液比(A，R=0.543)>提取时间(C，R=0.490)>提取次数(D，R=0.297)，在此条件下多糖提取最佳工艺条件为 A2B2C3D1，即料液比m(g)∶V(mL)=1∶30，提取温度 60 ℃，提取时间60 min，提取次数 2次，在此条件下获得多糖得率为(9.87±0.35)%.见表2.

图3提取时间对人参多糖得率的影响Fig.3Effect of extraction time on the yieldof Ginseng polysaccharides图4提取次数对人参多糖得率的影响Fig.4Effect of extraction times on the yieldof Ginseng polysaccharides

表2 正交试验结果分析Tab.2 Analysis results of orthogonal test

2.3 人参多糖的体外抗氧化能力

2.3.1 总抗氧化能力

图5人参多糖的总抗氧化能力Fig.5Total antioxidant capacity of Cinseng polysaccharides

图6人参多糖对DPPH自由基的清除能力Fig.6Scavenging ability of Ginseng polysac- charides to DPPH free radicals

图7人参多糖对羟自由基的清除能力Fig.7Scavenging ability of Ginseng polysac- charides to hydroxyl radicals

利用FRAP检测试剂盒对人参多糖的总抗氧化能力进行检测，在酸性条件下，抗氧化物可以还原Ferric-tripyridyltriazine(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ，在593 nm处测定蓝色的Fe2+-TPTZ，即可获得人参多糖的总抗氧化能力.在50～800 μg/mL内，人参多糖和水溶性维生素E的总抗氧化能力随着浓度的增加而增加，人参多糖的总抗氧化能力明显强于相同浓度下水溶性维生素E，且呈剂量依赖性增加.见图5.

2.3.2 DPPH自由基的清除

因DPPH自由基有单电子，在510～520 nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色，抗氧化剂能使单电子配对，从而使510～520 nm处吸光度值降低，溶液褪色，利用这一原理来测定人参多糖对DPPH自由基的清除能力.在25～800 μg/mL内，人参多糖和水溶性维生素E对DPPH自由基的清除能力呈剂量依赖性，人参多糖对清除DPPH自由基的能力明显强于相同浓度水溶性维生素E.见图6.

2.3.3 羟自由基的清除

过氧化氢将Fe2+氧化成Fe3+，在反应中添加水杨酸时，能够与—OH反应产生紫色化合物，在510 nm处有较大的吸收峰，当—OH自由基被清除时，会使有色化合物生成量减少，吸光度也随之减小，利用这一原理测定人参多糖对—OH的清除能力.在50～800 μg/mL内，人参多糖和水溶性维生素E对羟自由基的清除能力呈剂量依赖性增加，人参多糖清除羟自由基的能力明显强于相同浓度水溶性维生素E.见图7.

3 结 论

水提醇沉法作为常用的多糖提取方法，操作简单易行，不易破坏多糖的结构，是多糖提取率较高的一种方法.本研究通过探讨提取温度、料液比、提取时间、提取次数4个因素对人参多糖得率的影响，利用4因素3水平正交试验法，确定了人参多糖的最佳提取工艺为提取温度60 ℃、料液比m(g)∶V(mL)=1∶30、提取时间60 min和提取次数2次，在此条件下人参多糖最高得率为(9.87±0.35)%.

在正常状态下，机体内的氧化与抗氧化处于平衡状态，一旦平衡被打破，使机体倾向于氧化，自由基强大的伤害作用会引起机体的疾病甚至死亡，因此，寻找天然的抗氧化剂具有重要意义.有研究[20]显示：人参多糖具有较好的体外抗氧化活性.本研究表明：人参多糖的总抗氧化能力、清除DPPH自由基和羟自由基能力显著优于水溶性维生素E，且在50～800 μg/mL内呈剂量依赖性增加.

综上，人参的主要活性成分多糖具有毒副作用小、药理作用广泛等优点，尤其在抗氧化活性方面.在未来研究中，我们将进一步对不同方法提取的人参多糖的抗氧化能力进行对比研究，同时对人参多糖进行体内抗氧化活性研究，为长白山特色中药人参的开发利用提供理论依据.