NLRP3炎症小体的表达及多态性与急性冠脉综合征患者Caspase-1水平和冠脉病变程度的关系研究

吴 蔚 王晓萍 孙 琳 倪 青 邵 冰 张 晶 田 鑫

沈阳医学院附属第二医院心血管一病房，辽宁沈阳 110002

急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）是在冠状动脉粥样硬化基础上发展而来的临床综合征，其发生、发展过程中冠状动脉粥样斑块稳定性降低，而炎症反应的激活、内皮功能的损伤与其发生、发展密切相关，且炎症反应还能加重内皮损伤[1-2]。因此，炎症反应被认为是ACS 病情发展变化的核心环节，但目前关于ACS 患者体内炎症反应的调控机制尚未明确。Nod 样受体蛋白3（nodlike receptor protein 3，NLRP3）炎性小体是体内炎症反应的重要调节机制，其能够激活caspase-1[3-4]。NLRP3 基因rs10754558 位点多态性被认为是造成ACS 患者体内炎症反应异常激活的重要因素[5-6]。本研究旨在分析ACS 患者体内NLRP3 的表达及基因rs10754558 位点多态性与Caspase-1水平和冠脉病变程度的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月～2019年5月在沈阳医学院附属第二医院心内科住院的150 例临床诊断为ACS 的患者作为实验组，选取同期的疑似冠心病入院但行选择性冠状动脉造影术检查阴性的50 例患者作为对照组。ACS 确诊标准：参照美国《2014 AHA/ACC Guideline for the Management of Patients With Non-ST-Elevation Acute Coronary Syndromes：A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines》[7]及《急性冠脉综合征急诊快速诊治指南（2019）》[8]中的标准进行。纳入标准：①均符合ACS 的诊断标准；②所有ACS 患者住院期间行冠状动脉造影和经皮冠状动脉介入治疗术。排除标准：①不能耐受冠状动脉造影和经皮冠状动脉介入治疗术的患者；②合并严重肝肾功能异常者；③不愿意参与本研究者。所有入选个体在入选时均向本人及家属告知本研究方法及其意义，做到知情同意，并签署知情同意书。本研究经沈阳医学院附属第二医院医学伦理委员会审核批准。实验组中，男84 例，女66例；年龄54～65 岁，平均（56.13±4.55）岁；不稳定型心绞痛76 例，急性非ST 段抬高心肌梗死35 例，急性ST 段抬高心肌梗死39 例。对照组中，男32 例，女18 例；年龄55～65 岁，平均（56.32±4.17）岁。两组的性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 样本的采集及检测 ACS 组和对照组患者入院时进行外周血采集，共采集5 mL，采用全血基因组提取试剂盒（洛阳爱森生物科技有限公司）分离基因组DNA，设计针对rs10754558 位点的引物进行PCR 反应，得到的PCR 产物进行基因测序以判断rs10754558 位点的多态性。采用反转录聚合酶链反应（PT-PCR）检测各组冠状动脉造影前外周静脉血中NLPR3 和Caspase-1 的表达水平。分离外周静脉血，提取单核细胞，同时提取测定单核细胞总RNA，其中逆转录过程严格遵照Thermo 逆转录试剂盒[杰辉生物（北京）科技发展有限公司]步骤进行，应用Western Blot 方法进行PCR 产物的测定。

1.2.2 冠脉病变程度检测 所有入选的患者入院后均在局部消毒麻醉后，采用Seldinger 技术穿刺右侧桡动脉（若穿刺困难可经右侧股动脉），采用Judikins 方法进行常规多体位左右冠状动脉造影检查，观察冠脉病变情况（包括病变分支及各分支的狭窄程度）。

1.3 观察指标及评价标准

比较两组患者的NLPR3、Caspase-1 表达水平，根据冠状动脉造影检查结果，记录不同冠脉病变支数的NLPR3、Caspase-1 表达水平及Gensini 评分；观察不同NLRP3 基因型患者的冠脉病变情况，分析NLRP3表达及多态性与急性冠脉综合征患者Caspase-1水平和冠脉病变程度的关系。Gensini 评分是根据冠状动脉造影检查对各分支狭窄程度（狭窄直径与健康血管直径所成百分比）进行评分，用于判断冠脉病变狭窄程度，其中无狭窄为0 分，＜25%为1 分，25%～50%为2 分，＞50%～75%为4 分，＞75%～90%为8 分，＞90%～＜100%为16 分，100%为32 分，各分支评分之和即为Gensini 评分[9-10]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计学软件分析数据，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t 检验；计数资料以频数或百分率表示，采用χ2检验；采用Pearson 相关性分析NLPR3 表达水平与Caspase-1 表达水平、Gensini 评分的相关性，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者NLPR3、Caspase-1 表达水平的比较

实验组的NLPR3 和Caspase-1 表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 两组患者NLPR3、Caspase-1 表达水平的比较（±s）

表1 两组患者NLPR3、Caspase-1 表达水平的比较（±s）

与对照组比较，*P＜0.05

组别例数NLPR3Caspase-1实验组对照组150 50 1.33±0.43*0.58±0.03 2.45±0.52*1.57±0.06

2.2 实验组不同冠脉病变支数NLPR3、Caspase-1 表达水平及Gensini 评分的比较

实验组三支病变患者的NLPR3、Caspase-1 表达水平及Gensini 评分高于双支病变及单支病变患者，双支病变患者的NLPR3、Caspase-1 表达水平及Gensini 评分高于单支病变患者，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

2.3 NLPR3 表达水平与Caspase-1 表达水平、Gensini评分的相关性分析

Pearson 相关性分析显示，NLPR3 表达水平与Caspase-1 表达水平、Gensini 评分成正相关（r=0.714、0.781，P＜0.05）。

表2 实验组不同冠脉病变支数NLPR3、Caspase-1 表达水平及Gensini 评分的比较（±s）

表2 实验组不同冠脉病变支数NLPR3、Caspase-1 表达水平及Gensini 评分的比较（±s）

与单支病变比较，*P＜0.05；与双支病变比较，#P＜0.05

病变支数例数NLPR3Caspase-1 Gensini 评分单支病变双支病变三支病变36 53 61 1.01±0.02 1.46±0.14*1.69±0.21*#1.12±0.25 1.95±0.33*2.64±0.51*#22.19±3.17 30.05±3.22*44.81±2.86*#

2.4 两组患者NLRP3 多态性的比较

实验组中NLRP3 基因rs10754558 位点基因型中，CC 基因型44 例（29.33%），GG 基因型46 例（30.67%），GC 基因型60 例（40.00%）；对照组NLRP3 基因rs10754558 位点基因型中，CC 基因型40 例（80.00%），GG 基因型4 例（8.00%），GC 基因型6 例（12.00%）。实验组NLRP3 基因中的GG 基因型和GC 基因型所占比例高于对照组，CC 基因型的所占比例低于对照组（P＜0.05）。

2.5 实验组NLRP3 的多态性与不同冠脉病变支数的关系分析

实验组中，三支病变多见于NLPR3 的GG 型和GC 型（表3）。

表3 实验组NLRP3 的多态性与不同冠脉病变支数的关系分析[n（%）]

3 讨论

NLRP3 炎性小体能够调节体内炎症反应，其由NLRP3、CARD、Caspase-1、ASC 组成，活化的NLRP3可以与CARD8 相互作用激活Caspase-1[11-12]。NLRP3基因rs17054558 位点的多态性会影响NLRP3 的功能，进而导致炎症反应的改变[13-15]。Gensini 评分是用于判断冠脉病变狭窄程度的评分方法。本研究结果显示，实验组三支病变患者的NLPR3、Caspase-1 表达水平及Gensini 评分高于双支病变及单支病变患者，双支病变患者的NLPR3、Caspase-1 表达水平及Gensini 评分高于单支病变患者，差异有统计学意义（P＜0.05）提示NLRP3、Caspase-1 表达水平与ACS 的病变程度具有相关性。Pearson 相关性分析显示，NLPR3 表达水平与Caspase-1 表达水平、Gensini 评分成正相关（r=0.714、0.781，P＜0.05），进一步验证了上述结论。

本研究对NLRP3 基因rs10754558 位点多态性的基因型及等位基因进行了分析，结果显示，实验组NLRP3 基因中的GG 基因型和GC 基因型所占比例较对照组高，CC 基因型所占比例较对照组低（P＜0.05），提示NLRP3 基因rs10754558 位点GG 基因型和GC 基因型增多、等位基因G 增多与ACS 的发生密切相关，说明NLRP3 基因rs10754558 位点多等位基因G 增多会增强NLRP3 炎性小体的活性，通过炎症反应的激活造成ACS 患者发生内皮功能损伤。本研究还显示，实验组中三支病变多见于NLPR3 的GG型和GC 型，进一步说明等位基因G 增多与ACS 的发生密切相关。

综上所述，NLRP3 基因rs10754558 位点的多态性与ACS 的发生和发展密切相关；rs10754558 位点等位基因G 增多、GC 基因型和GG 基因型增多会增加炎性小体活性，能预示患者冠脉可能病变重，并且预后不良。