低氧诱导因子对SD大鼠髓核细胞凋亡路径中相关蛋白表达的影响

李 旭 叶 放 刘一秀 赵 宇 谢 鑫 杨立群 屠冠军

1.沈阳医学院附属中心医院足踝外科，辽宁沈阳 110024；2.辽宁中医药大学机能实验中心，辽宁沈阳 110847；3.中国医科大学辽宁省计划生育研究所，辽宁沈阳 110031；4.中国医科大学第一临床医院骨科，辽宁沈阳 110001

低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是诱导低氧基因和维持细胞氧内环境稳定的核心因子，可以调节能量代谢，血管形成，细胞凋亡，细胞分化，基质合成等相关基因的表达[1]。间盘组织处于一种低氧环境中，研究表明HIF－1α 在间盘中有表达[2]。Ha[3]等研究发现，在不同程度人突出椎间盘中，HIF-1α 的表达程度与细胞凋亡程度之间存在高度相关性，而其作用于髓核细胞凋亡的路径尚不完全清楚。本研究探讨HIF-1α 在间盘细胞凋亡中的作用，通过检测HIF-1α 诱导凋亡途径中凋亡相关蛋白的表达情况，揭示HIF-1α 在SD 大鼠髓核细胞线粒体凋亡路径中所起的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

选择刚断奶的30日龄SD 大鼠，一共20 只，清洁级，由中国医科大学实验动物中心提供，实验动物合格证号：SCXK（辽）2013-0001，检疫合格备用，经过相关动物伦理委员会审核同意，选择光线充足、通风良好的实验环境，适应性喂养1 周后备用，其中10 只为雌性，10 只为雄性，体重为50～60 g。

SABC 免疫组化试剂盒（博士德公司，批号：QD82102），兔抗鼠Ⅱ型胶原一抗（Neomakers 公司，批号：SC17852），山羊抗兔抗体（IgG）（北京百奥莱博科技有限公司，批号：F030212），单克隆兔抗鼠HIF-1α一抗（Santa Cruz 公司），CAY10585（cayman 公司，批号：10012682-5），CoCl2（上海迈瑞尔化学技术有限公司，批号：20080890），CO2培养箱（德国Seracell），三气低氧培养箱（型号：Heraeus cell 150），倒置相差显微镜（奥特光学器材厂），正置光学显微照相系统（奥特光学器材厂，型号：Olympus BX51），电泳仪（美国IKA 公司），转印仪（美国IKA 公司），722 分光光度计（美国IKA 公司），流式细胞仪（Calibar BD USA）。

1.2 髓核细胞原代培养及纯化

在无菌条件下取30日龄SD 大鼠腰椎髓核组织，用小剪刀将其剪碎成约1 mm3的碎块。以0.25%的胰蛋白酶液于室温下消化20 min。低速离心（1000 r/min）10 min，吸取上清液，以2%的Ⅱ型胶原酶于孵箱中消化过夜。髓核细胞经无菌尼龙滤网过滤（孔径75 μm），计数。将细胞接种于12 孔板中，按1×104/mL 密度接种。在37℃、5% CO2的培养箱中培养，培养基为DMEM/F12 加20%的胎牛血清，每3 天换液1 次，按时用倒置显微镜观察、拍照。细胞融合为单层时用胰蛋白酶消化并进行细胞传代。

将培养所得细胞悬液置于无血清培养瓶中静置4 h，实时在相差显微镜下对培养的细胞进行观察，当发现细胞贴壁摇晃培养瓶贴壁细胞不浮起时，将上液倒入另一培养瓶继续培养，反复操作，以便将髓核细胞分离开来。

1.3 使用SABC 法对Ⅱ型胶原进行检测

细胞爬片后以10%福尔马林固定，30% H2O2一份加纯甲醇50 份混合以灭活内源性过氧化物酶，滴加5% BSA 封闭液阻断，室温20 min 后加稀释的兔抗鼠Ⅱ型胶原一抗，37℃1 h，滴加山羊抗兔IgG 抗体，37℃20 min，滴加试剂SABC，DAB 显色后脱水、透明、封片后观察。

1.4 实验分组及施加处理因素

将培养所得的髓核细胞分为四组进行处理，具体如下。A 组（低氧条件组）：O25%，CO25%，N290%（模拟正常间盘环境）；B 组（过度低氧条件组）：O22%，CO25%，N293%（模拟退变间盘环境）；C 组（低氧并经Co-Cl2处理组）：O25%，CO25%，N290%（HIF-1α 高表达）；D 组（低氧条件并经CAY10585 处理组）：O25%，CO25%，N290%（HIF-1α 表达受抑制）。通过促进（C组）与抑制（D 组）HIF-1α 表达，并与对照组（A 组）进行比较，验证HIF-1α 表达多少与p53、Bax、caspase3、Bcl-2 表达趋势间的关系及与髓核细胞凋亡之间的关系。各组在各自条件下培养24 h。CoCl2浓度为200 mmol/L，CAY10585 浓度为0.01 mmmol/L。

1.5 Western Blot 检测各蛋白表达

收集各组细胞，提取蛋白，蛋白定量，SDS-PAGE电泳，转印，封闭过夜，碱性磷酸酶显色。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡

消化，洗涤，调整细胞浓度到1×106/mL 后离心，固定，PI 染色，上机检测，输入计算机分析细胞凋亡的百分率。

1.7 统计学方法

采用SPSS 16.0 统计学软件进行相关分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较先行ANOVA 检测，两组间比较采用t 检验；相关性分析采用Pearson 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 使用倒置相差显微镜对细胞形态进行观察

髓核细胞在显微镜下为梭形或多角形，轮廓比较清楚，细胞核为圆形（图1）。

图1 倒置显微镜下查看培养细胞的形态（100×）

2.2 免疫组化法Ⅱ型胶原染色

髓核细胞浆中表达的Ⅱ型胶原在显微镜下染色呈现为棕色染色，细胞核核圆形呈蓝色染色（图2）。

图2 显微镜下观察染色的髓核细胞镜下形态（SABC，400×）

2.3 Western Blot 检测各相关蛋白表达的情况及流式细胞术检测各组髓核细胞凋亡的情况

Western Blot 呈现的结果显示，HIF-1α、p53、Bax、Bcl-2、caspase3 在各组中均有表达（图3）。单因素方差分析结果显示，各组的相关蛋白表达情况及髓核细胞凋亡情况比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。C 组中HIF-1α 蛋白的表达高于A 组和B 组，B 组中HIF-1α 蛋白的表达高于A 组，D 组中HIF-1α 蛋白的表达低于A 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。p53、Bax、caspase3 蛋白表达的趋势在各组中相一致，在C组中最高，且表达程度高于A 组和B 组，B 组高于A 组，D 组表达最低，而且亦低于A 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。Bcl-2 蛋白的表达情况上，C 组中最低，低于A 组，D 组最高，高于A 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。流式细胞术检测各组细胞凋亡情况，单因素方差分析结果显示，各组的凋亡率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其中C 组高于B 组和A 组，B 组高于A 组，D 组低于A 组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

图3 Western Blot 检测各相关蛋白表达的情况

2.4 流式细胞术检测各组细胞凋亡的情况

细胞凋亡率上，C 组＞B 组＞A 组＞D 组（图4）。

2.5 HIF-1α、p53、Bax、Bcl-2 及caspase3 变化与凋亡率的相关性分析

HIF-1α、p53、Bax、Bcl-2 及caspase3 变化与凋亡率均呈正相关性（P＜0.05）（表2）。

3 讨论

目前临床上多种脊柱退变性疾病都是由椎间盘的退变[4]引起的，严重影响着患者的工作及生活质量，而在对此类疾病的治疗方面不论是通过非手术治疗还是通过手术治疗都不能得到令人满意的效果。因此，很多学者越来越热衷于探索椎间盘退变的分子生物学机制研究，以期在出现症状之前可以早期干预椎间盘组织的退变并逆转此过程[5]，以达到早期治疗脊柱退行性疾病的目的。椎间盘组织中的髓核细胞是主要功能细胞，研究表明髓核细胞凋亡在间盘组织退变过程中起到了至关重要的作用[6-7]。

表1 四组相关蛋白表达情况及髓核细胞凋亡情况的比较（±s）

表1 四组相关蛋白表达情况及髓核细胞凋亡情况的比较（±s）

B 组与A 组比较，*P＜0.05

组别HIF-1αp53BaxBcl-2caspase3凋亡率（%）A 组B 组C 组D 组F 值P 值tC 组与A 组比较值PC 组与A 组比较值tC 组与B 组比较值PC 组与B 组比较值tD 组与A 组比较值PD 组与A 组比较值0.241±0.025 0.352±0.031*0.591±0.021 0.204±0.031 12.635＜0.05 25.819 0.000 14.273 0.000 23.111 0.000 0.417±0.029 0.446±0.021*0.721±0.023 0.311±0.019 11.058＜0.05 18.365 0.000 19.434 0.000 30.731 0.000 0.511±0.032 0.581±0.011*0.784±0.035 0.293±0.018 10.117＜0.05 12.872 0.000 12.373 0.000 27.896 0.000 0.516±0.018 0.409±0.019 0.384±0.033 0.582±0.026 9.869＜0.05 7.852 0.000 1.468 0.180 10.538 0.000 0.281±0.029 0.322±0.018*0.433±0.029 0.217±0.023 13.386＜0.05 8.287 0.000 7.272 0.000 13.049 0.000 0.181±0.021 0.252±0.033*0.328±0.019 0.095±0.018 14.362＜0.05 11.607 0.000 14.630 0.002 19.907 0.000

图4 各组细胞的凋亡情况

表2 HIF-1α、p53、Bax、Bcl-2 及caspase3 变化与凋亡率的相关性分析

HIF-1α 是Semenza 等于20世纪90年代发现的一种细胞内重要因子，其参与了体内的许多生物学过程，起到维持细胞、组织在低氧条件下的内部环境的稳定，从而使细胞适应此种低氧的环境[8-10]。间盘组织中因为没有血管，因此营养只能是通过终板和纤维环的途径来进行传递。随着人的机体老化以及某些病理的因素，终板软骨组织逐渐出现钙化，因此氧气等营养物质的供应路径受到阻塞，致使椎间盘组织内的低氧状态愈加严重。相关文献报道[1]，椎间盘组织中的髓核细胞正是处于这种低氧浓度的组织环境之中，因此可以诱导髓核细胞通过某个途径来表达HIF-1α，进而以达到使整个间盘组织能够适应这种低氧浓度的组织内环境，但也有相关实验表明HIF-1α 的过度表达也可能起反作用，加速间盘组织的退变过程[5]。目前，在对软骨细胞的研究中也发现HIF-1α 对其具有调节作用[11]，髓核细胞与软骨细胞属于同源细胞，具有很高的相似性，髓核细胞也是主要靠无氧代谢过程来获取其代谢所需的能量[12]。有研究[13-14]表明，髓核细胞处于间盘这种低氧浓度的环境之中，可以促使髓核细胞表达HIF-1α，而HIF-1α 洽是这种细胞内的重要调节因子，从而使间盘组织中的细胞适应这种低氧浓度环境。在这个过程中其参与了间盘组织的营养代谢，血管的形成，以及髓核细胞凋亡和分化等重要环节[15]。

以往的研究[16]表明，HIF-1α 可以通过多种方式和途径以使细胞适应生存于这种低氧浓度的环境。Moritz 等[17]的研究说明，HIF-1α 可使脾细胞能够在生长代谢过程中适应低氧条件，但是其研究也说明当低氧刺激过大时HIF-1α 反而可以导致细胞的凋亡。退变间盘组织中的氧浓度更低，退变间盘组织中测得的氧分压明显低于正常的间盘组织。文献报道[3]在临床手术中所得的人突出间盘中，其间盘的突出程度不同，测得的HIF-1α 的表达程度也明显不同，同样测得的髓核细胞凋亡程度也明显不同，其二者的相关性分析结果表明二者之间存在高度相关性。笔者在之前的研究中证明了大鼠的髓核细胞中HIF-1α 过度表达可以导致原代培养的髓核细胞凋亡的增加，因此笔者认为在一定情况下HIF-1α 是髓核细胞发生凋亡的一个诱因。细胞凋亡是细胞的程序性死亡过程，其发生过程受到一定程度的调控，HIF-1α 可以通过一定的调节过程来影响凋亡相关基因在细胞内的表达，最终可能造成细胞凋亡[18]。近些年来研究的重点集中于HIF-1α 在肿瘤细胞凋亡中的作用及机制，相关研究证明HIF-1α 可以在细胞内通过某些调节机制从而激活能促进细胞发生凋亡的分子、或者是能够抑制抗凋亡的相关分子的表达，从而达到促发细胞凋亡的一系列信号转导机制，最终使细胞发生程序性死亡，这个过程就是所说的基因调控机制，其最终的结果就是通过一个共同的路径影响细胞的程序性死亡过程[19]。调控细胞发生凋亡的分子有很多，如Bcl-2 家族、细胞周期蛋白或其他调节分子。本研究分析HIF-1α、p53、Bax、Bcl-2 及caspase3 变化与凋亡率的相关性，结果显示，HIF-1α、p53、Bax、Bcl-2 及caspase3 变化与凋亡率均呈正相关性（P＜0.05）。p53 是一种抑癌因子，研究表明，在低氧条件下，低氧诱导因子突变型肝癌细胞不能增加p53 的表达，而野生型则可以促进p53 表达，并可以发现有大量的肝癌细胞发生程序性死亡[20]。Greijer 等[21]的研究表明，p53 基因敲除后低氧促发的细胞凋亡明显受到抑制。而对于在髓核细胞中HIF-1α是通过哪些方式来促进细胞凋亡却没有定论，本实验通过调控HIF-1α 蛋白的表达并同时测定p53、Bcl-2、Bax、caspase3 蛋白的表达情况，提示了HIF-1α 表达与髓核细胞的线粒体凋亡路径有一定相关性，但具体的作用机制尚不清楚，需要进一步的实验证明。

4 小结

HIF-1α 表达程度的增加可以诱发髓核细胞的凋亡程度也相应提高，从而说明了HIF-1α 可以通过某种机制促发髓核细胞凋亡。通过HIF-1α 不同表达程度下检测线粒体凋亡路径中相关因子p53、Bax、Bcl-2、caspase3 的表达情况，说明了HIF-1α 与这些蛋白表达的相关性，也预示了HIF-1α 对SD 大鼠髓核细胞线粒体凋亡路径的影响作用。