STAT3及其多态性在HPV16所致宫颈癌发生过程中的作用研究

莫小亮 覃桂荣 蒋晓莉 周卓琳 袁 媛

广西医科大学第一附属医院计划生育病区，广西南宁 530021

女性生殖系统常见一类恶性肿瘤为宫颈癌，疾病发病率仅次于乳腺癌，位居女性恶性肿瘤第二位。近些年来，宫颈癌疾病呈现上升及年轻化趋势，成为威胁中青年女性健康的恶性疾病。早期阶段宫颈癌症状隐匿，缺乏特异性，多数患者确诊就医发展至中晚期，错过最佳治疗时间，患者预后较差[1]。目前对宫颈癌发病机制尚不明确，临床缺乏敏感、特异的早期诊断方法及有效治疗手段[2]。因此，探索宫颈癌发病相关分子机制，寻找肿瘤诊断新型分子标志物及治疗靶标具有重要临床意义。相关研究表明[3]，人乳头状瘤病毒（HPV）感染作为宫颈癌发生重要致病因素，与多个方面因素影响，需全面对致病机制深入探讨。转录活化子（signal transducer and activator of transcription，STAT）参与细胞增殖、分化、凋亡以及血管形成等过程，且与肿瘤产生联系紧密[4]。本研究旨在探讨STAT3 基因表达及其多态性在HPV16 所致宫颈癌发生过程中的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

抽取2015年1月～2017年12月广西医科大学第一附属医院收治的40 例慢性宫颈炎患者、27 例宫颈上皮内瘤变患者及17 例宫颈癌患者作为研究对象。纳入标准：①患者均经临床确诊；②患者及家属知晓本研究开展经过，并自愿参与；③临床依从性偏高，配合后续研究开展。排除标准：①中途转院及失访者；②存在影响研究开展的其他疾病。慢性宫颈炎患者中，年龄27～64 岁，平均（45.6±4.5）岁；病程1～23 个月，平均（6.9±1.5）个月。宫颈上皮内瘤病变患者中，年龄29～66 岁，平均（46.2±5.1）岁；病程1～24 个月，平均（7.5±1.4）个月。宫颈癌患者中，年龄29～64 岁，平均（45.9±4.2）岁；病程1～24 个月，平均（7.6±1.3）个月。三组患者的一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。另外收集10 名健康体检者的样本资料，在PCR-反向点杂交法下展开HPV16 E6 蛋白基因测定，为阴性表达对照。本研究经广西医科大学第一附属医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

HPV16 E6 蛋白测定：标本制作成石蜡组织，切片后进行HE 染色，开展分型检测HPV 亚型，采取聚合酶链反应（PCR）-反向点杂交法。并采取免疫组化Supervision TM 二步法，检测标本中HPV16 E6 蛋白表达水平，检测方法为切片染色，要求病理科医师进行双盲阅片，HPV16 E6 蛋白表达阳性细胞染色表现为棕黄色颗粒，表达位置为细胞核，镜下染色后，阳性细胞及染色强度结果开展半定量评分。依据细胞着色深浅分为无色、浅黄色、棕黄色、棕褐色，分别为0、1、2、3 分，0～1 分为阴性，2 分以上为阳性。

STAT3 基因测定：制备病理组织标本，并取各组病例组织5 cm×5 cm，利用10%甲醛固定，石蜡包埋，将其切片为厚度为3 μm 切片，采取HE 染色，采用聚合酶链反应（PCR）测定STAT3 基因型，构建STAT3引物（上游引物：5′-GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3′，下游引物：5′-GTTGGGCTCAAATACGGTGG-3′），以β球蛋白基因（350 bp）作为参照基因，取上下游引物各2 μL、DNA 聚合物25 U、氯化钾50 mmol/L、氯化镁1.5 mmol/L 及相应缓冲液。反应条件：94℃预变性5 min，变形30 s，63℃下退火30 s，72℃延伸30 s，经35 个循环后72℃延伸5 min，采用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR 扩增产物基因型。采取PCR-制片段长度多态性（RFLP）对各组STAT3 基因C1697G 多态性测定。

1.3 观察指标

采用免疫组化检测HPV16 E6 在健康体检者、慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变及宫颈癌中的表达。对E6、STAT3 蛋白在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变及宫颈癌中的表达情况进行统计，比较STAT3 基因多态性在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变及宫颈癌基因中表达情况。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变及宫颈癌患者E6、STAT3 蛋白表达情况的比较

宫颈癌患者的E6 蛋白阳性表达率（76.47%）高于慢性宫颈炎（2.50%）、宫颈上皮内瘤变（48.14%），STAT3 蛋白阳性表达率（82.35%）高于宫颈上皮内瘤变（44.44%）、慢性宫颈炎（5.00%），差异有统计学意义（P＜0.05）；宫颈上皮内瘤变患者的E6 及STAT3 蛋白阳性表达率均高于慢性宫颈炎，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变及宫颈癌患者E6、STAT3 蛋白表达情况的比较[n（%）]

2.2 慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变及宫颈癌患者STAT3基因多态性表达情况的比较

G/G 型占比中，宫颈癌（5.88%）、宫颈上皮内瘤变（59.26%）低于慢性宫颈炎（92.50%），宫颈癌低于宫颈上皮内瘤变，差异有统计学意义（P＜0.05）；C/C 型占比中，宫颈癌（82.35%）、宫颈上皮内瘤变（25.93%）高于慢性宫颈炎（2.50%），宫颈癌高于宫颈上皮内瘤变，差异有统计学意义（P＜0.05）；慢性宫颈炎（5.00%）、宫颈上皮内瘤变（14.81%）、宫颈癌（11.76%）的G/C 型占比比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2 慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变及宫颈癌患者STAT3 基因多态性表达情况的比较[n（%）]

2.3 典型案例分析

健康体检者PCR-反向点杂交法下HPV16 E6 蛋白基因测定阴性表达对照见图1；慢性宫颈炎患者，45 岁，PCR-反向点杂交法下HPV16 E6 蛋白基因在慢性宫颈炎患者中的表达见图2；宫颈上皮内瘤变患者，44 岁，PCR-反向点杂交法下HPV16 E6 蛋白基因在宫颈上皮内瘤变患者中的表达见图3；宫颈癌患者，42 岁，PCR-反向点杂交法下HPV16 E6 蛋白基因在宫颈癌中的表达见图4。

3 讨论

妇科常见一类恶性肿瘤为宫颈癌，数据显示每年新发患病人数达到50 万，占所有妇科癌症的10.00%，总计发病率为所有肿瘤的5.00%，仅次于乳腺癌，在发病地区统计结果上，85.00%以发展中国家为主，占据所有病例的80.00%[5]。据统计，全球宫颈癌发病死亡人数统计数据为27 万例，发展中国家占4/5。对国内宫颈癌发病病例统计显示，我国占据全世界总发病人数1/3，且每年以2%～3%速度增长，疾病发病率呈现年轻化趋势[6]。

图1 HPV16 E6 表达阴性对照（免疫组化，100×）

图2 HPV16 E6 在慢性宫颈炎中的表达（免疫组化，100×）

图3 HPV16 E6 在宫颈上皮内瘤变中的表达（免疫组化，100×）

图4 HPV16 E6 在宫颈癌中的表达（免疫组化，100×）

相关研究证实[7]，绝大多数宫颈上皮不典型增生、宫颈癌患者中，经检测存在HPV 感染。99.7%宫颈癌标本中可检测出HPV-DNA。HPV 感染与宫颈上皮内瘤变及宫颈癌恶性病变有显著联系。因此，HPV 感染可作为宫颈癌病变重要前提。随着HPV 感染人群数量增多，宫颈癌发病人群数量相对提升，但HPV 感染严重病变程度作为宫颈癌发病重要前提，其他外界因素同样占据重要地位，如饮食、卫生习惯等，表明疾病形成是多种致癌因素长期共同作用的结果[8]。STAT 作为介导细胞信号转导的转录因子，是JAK-STAT 信号转导途径重要环节，转导始于细胞表面受体，当成分与特异性DNA 启动子序列结合，信号转至细胞核，并调控基因表达，参与细胞增殖、分化、凋亡及血管形成过程，在肿瘤发生中起着重要作用[9-10]。STAT3 位于11 号染色体，并被多种细胞因子激活，功能复杂。正常生理状态下，STAT3 信号转导途径在多种生理过程中发挥重要作用，如胚胎发育、器官形成、先天及后天免疫调节。同样，当机体感染多种致癌蛋白后，STAT3 被激活，如V-Src、V-Fps、V-Erk 等，上调凋亡抑制基因Bcl-XL、Mcl-1 及细胞周期调节基因cyclinDl抑制细胞凋亡，激活血管内皮生长因子启动子，可诱导肿瘤血管生成。STAT3 组成性活化能阻断凋亡细胞恶化转化，能促进肿瘤细胞增殖、血管形成，阻断STAT3表达对肿瘤的治疗具有巨大的潜在价值。

本研究检测了HPV16 E6 及STAT3 蛋白、STAT3基因多态性的表达情况，结果显示，宫颈癌患者的STAT3 蛋白阳性表达率（82.35%）高于宫颈上皮内瘤变（44.44%）、慢性宫颈炎（5.00%），差异有统计学意义（P＜0.05）。有研究证实[11]，STAT3 的组成性活化能促进细胞的恶性转化并阻断调亡，促进肿瘤细胞的增殖，血管形成，在人类子宫内膜癌及宫颈癌中处于活性状态，当抑制STAT3 组成型激活可能是干预这两类妇科疾病有效靶点。鉴于STAT3 的致癌作用，本研究将其与宫颈癌密切相关的HPV16 E6 蛋白相结合，分析二者在不同程度宫颈病变组织中的表达。有研究发现[12]，STAT3 在宫颈癌表达水平与癌前病变水平呈现显著差异，随着宫颈病变程度加重，STAT3 表达阳性率相应升高，与本研究得出的论点一致。同时还有研究发现[13]，HPV16 E6 蛋白及STAT3 在宫颈癌中表达具有一定相关性。因此，恶性肿瘤转化中，HPV16 与STAT3 之间存在某种相互关系。甚至有相关研究[14]指出，恶性组织切片中，HPV DNA 整合增加编码E6、E7 癌蛋白的mRNA 的稳定性，导致E6、E7癌蛋白表达增强，对细胞与信号转导因子造成影响。STAT3 作为细胞信号转导的转录因子，与HPV E6 与之间必然存在着某种关系，但其与STAT3 在宿主宫颈细胞恶性转化过程中的相互作用机制仍需深入探究。基因多态性是目前研究热点，当一个基因多态性发生改变时可引起其他基因型发生相应改变，进而引发相关疾病，基因多态性可作为疾病诊断依据及预后判断重要指标。STAT3 基因多态性分包括G/G 型、G/C 型、C/C 型，本研究进一步对STAT3 基因多态性进行分析比较，结果显示，宫颈癌、宫颈上皮内瘤变的G/G 型占比（5.88%、59.26%）低于慢性宫颈炎（92.50%），差异有统计学意义（P＜0.05）；而慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的C/C 型占比分别为2.50%、25.93%、82.35%，比较差异有统计学意义（P＜0.05），因此，HPV 感染风险上升，宫颈癌发生风险上升，C/C 基因占比伴随疾病程度增加，则整体患宫颈癌机率增高。Zhou 等[15]研究指出，随着宫颈病变程度加重，患者STAT3 基因C/C 型显著增高，G/G 型占比降低，提示宫颈癌发生与STAT3 联系紧密，C/C 基因型与HPV 感染风险上呈现正比关系。STAT3 基因突变可增加HPV 感染风险以及宫颈癌患病风险，其发病机制往往与HPV 感染后激活STAT3 信号通路，介导E6、E7 致癌蛋白通路相关，致癌蛋白经多种途径，促进细胞增殖、恶化及血管形成宫颈癌[16]。宫颈癌产生为多种因素共同影响结果，此时STAT3 基因突变，增加HPV16 感染风险及宫颈癌风险，提示STAT3 在宫颈癌发生、病情发展中起着重要作用，可作为临床诊断重要指标。

综上所述，STAT3 与HPV16 所致宫颈癌发生联系紧密，提示STAT3 和HPV16 在宫颈病变发生和发展过程中发挥重要作用。