平喘颗粒对哮喘小鼠肺组织MMP-9和TIMP-1水平的影响∗

高风丽 李竹英

（黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040）

支气管哮喘（简称哮喘）是以气道慢性炎症，气道高反应性和气道重塑为主要特征，因其不断增长的发病率和死亡率而备受世界关注。中国肺健康研究显示，目前我国哮喘患病人数约4 570万，总体发病率达4.2%［1］。平喘颗粒是刘建秋教授传承前辈思想并结合多年临床实践经验所创立，刘教授认为哮喘慢性持续期的病机根本为阳虚痰盛，故平喘颗粒组方的核心思想为温阳益气、化痰平喘。前期研究发现［2-4］，平喘颗粒可以通过干预气道上皮细胞自噬与凋亡，调节树突细胞免疫功能，降低嗜酸性粒细胞活性和功能等途径发挥治疗哮喘的作用，但其对哮喘气道重塑的具体机制尚不明确。基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）能够通过影响细胞外基质的沉积和降解以及平滑肌细胞的功能和迁移来引发气道重塑［5-6］。本实验通过观察平喘颗粒对哮喘小鼠肺组织中MMP-9、TIMP-1水平的影响，探讨平喘颗粒在改善气道重塑方面的作用机制，为临床应用平喘颗粒治疗哮喘提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取8周龄健康清洁级雌性BALB/c小鼠30只，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK（辽）2015-0001，体质量（20±2）g，饲养环境温度（22±1）℃，湿度为45%～55%，自由进食饮水，适应性喂养1周后开始实验。

1.2 试药与仪器 平喘颗粒，组方：淫羊藿200 g，太子参150 g，黄芪 150 g，五味子150 g，知母100 g，炙麻黄100 g，款冬花（炙）150 g，地龙100 g，罂粟壳40 g。药材加水煎煮2次，每2小时过滤1次，通过醇沉方式［7］浓缩成稠膏，相对密度为1.20～1.25（60 ℃），加入蔗糖、糊精适量制成1 000 g颗粒，由黑龙江中医药大学附属第一医院制备，批号：20180723。普米克令舒（吸入用布地奈德混悬液），2 mL/支，阿斯利康公司，批号：H20140475。卵蛋白（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，A107820）；MMP-9 ELISA试剂盒（厦门仑昌硕生物科技有限公司，20381）；TIMP-1 ELISA试剂盒（厦门仑昌硕生物科技有限公司，20382）。超声雾化机NB-150U，欧姆龙自动化（中国）有限公司；石蜡切片机RM2235，德国Leica；Lx81研究级倒置荧光显微镜，日本Olymps公司；酶标仪ELX-800，美国伯腾仪器有限公司；微量移液器Proline，芬兰百得实验室仪器（中国）有限公司；电热恒温培养箱DH36001B，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 分组与造模 40只BALB/c小鼠随机分为4组，每组10只，分别是对照组、哮喘组、平喘颗粒组、普米克令舒组。对照组腹腔注射及雾化吸入等体积生理盐水代替OVA激发，其余3组进行慢性哮喘造模。根据文献［8］方法，应用OVA致敏液［100 μg OVA+1 mg Al（OH）3］激发BALB/c小鼠，制备慢性哮喘小鼠模型。于实验第1、14日给予小鼠腹腔注射0.2 mL致敏液，22 d后进行雾化激发，雾化吸入1%OVA溶液，每次30 min，每周进行3次，连续激发8周。

1.4 给药方法 从第1次雾化激发的当天开始，平喘颗粒组按前期研究的最佳质量浓度（1.08 g/mL）含药溶液灌胃，根据人体与动物的每千克体质量剂量折算系数计算，按照0.1 mL/10 g灌胃，持续给药8周，激发阶段则每次激发前1 h灌。对照组和哮喘组给予等体积的0.9%氯化钠注射液灌胃，灌胃时间同平喘颗粒组。普米克令舒组给予普米克令舒药液0.5 mg/mL（布地奈德1 mg与0.9%氯化钠注射液2 mL混合），每次雾化30 min，雾化时间同平喘颗粒组。

1.5 标本采集与检测 1）各组小鼠末次激发24 h后处死，开胸取固定的肺组织行石蜡包埋、切片，将病理切片行Masson染色，光镜下观察肺组织的病理学改变。2）采用计算机图像分析系统（Image-Pro Plus Ver⁃sion 6.0）分析病理图像，测定支气管基底膜周径（Pbm）、气道平滑肌面积（WAm）、支气管总面积（WAt），并将测得的WAm、WAt用Pbm标准化，以WAm/Pbm、WAt/Pbm数值分别表示气道平滑肌和支气管管壁的厚度。3）取约小鼠1/2右肺组织匀浆，用ELISA法测定肺组织中MMP-9和TIMP-1的水平，具体操作方法严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.6 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量数据以（）表示，组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肺组织Masson染色结果比较 对照组小鼠肺组织及支气管结构基本上处于正常状态；哮喘组小鼠气管壁和气道平滑肌明显增厚，管腔狭窄，上皮组织增生、脱落，黏膜肿胀、充血，且气道周围可见较多的蓝色胶原纤维组织。平喘颗粒组上述病理结构改变明显减轻，但与正常组仍有差距，气道周围可见少量的蓝色胶原纤维组织。普米克令舒组上述病理结构改变和胶原沉积均明显减轻，见图1。

图1 各组小鼠肺组织Masson染色（200倍）

2.2 各组小鼠WAm/Pbm、WAt/Pbm比较 见表1。与对照组比较，哮喘组小鼠气道平滑肌厚度、支气管管壁厚度明显增加（P<0.05）。给予平喘颗粒和普米克令舒治疗后小鼠气道平滑肌厚度、支气管管壁厚度明显降低（P<0.05），两组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 各组小鼠WAm/Pbm、WAt/Pbm比较（μm2/μm，±s）

表1 各组小鼠WAm/Pbm、WAt/Pbm比较（μm2/μm，±s）

注：与对照组比较，∗P<0.05；与哮喘组比较，△P<0.05。下同。

组别对照组哮喘组平喘颗粒组普米克令舒组n 10 10 10 10 WAm/Pbm 13.01±0.60 27.56±0.94*15.36±0.39*△15.50±0.27*△WAt/Pbm 35.59±1.64 70.69±3.01*49.04±1.41*△49.53±1.79*△

2.3 各组小鼠肺组织MMP-9和TIMP-1表达水平比较 见表2。与对照组比较，哮喘组小鼠肺组织中MMP-9和TIMP-1的表达水平明显增高（P<0.05）。给予平喘颗粒和普米克令舒治疗后小鼠肺组织中MMP-9和TIMP-1的表达水平明显降低（P<0.05），两组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。

表2 各组小鼠肺组织MMP-9和TIMP-1表达水平比较（ng/L，±s）

表2 各组小鼠肺组织MMP-9和TIMP-1表达水平比较（ng/L，±s）

组别对照组哮喘组平喘颗粒组普米克令舒组n 10 10 10 10 MMP-9 55.22±2.10 92.77±4.89*62.39±2.53*△60.74±3.32*△TIMP-1 49.11±1.19 83.01±3.54*54.10±1.73*△53.67±2.63*△

3 讨论

气道重塑是哮喘的重要病理特征，是哮喘反复发作和迁延不愈所导致的一系列气道结构的改变，能够导致患者出现不可逆的气流受限以及持续存在的气道高反性，成为哮喘难以根治的主要原因。气道重塑的过程极为复杂，主要改变包括气道上皮细胞黏液化生、细胞外基质合成和沉积增加、平滑肌细胞增殖迁移、上皮下胶原沉积和纤维化等。研究表明，细胞外基质在气道重塑中起到了重要作用，其在气道壁过度沉积和降解失衡会导致气道结构和功能的改变［9］。MMP-9是调节细胞外基质的主要限速酶，与其特异性抑制剂TIMP-1共同维持着细胞外基质的正常生长和机体内环境的稳定。正常生理情况下，MMP-9和TIMP-1在机体中保持平衡状态，若MMP-9和TIMP-1出现过度分泌及比例失调时，这种平衡状态将被打破，导致气道壁的细胞外基质出现异常状态从而引发气道重塑［10-11］。MMP-9可以通过降解以Ⅳ型胶原为主的细胞外基质和血管中的胶原成分，诱导气道平滑肌细胞增殖、分化、迁移至气道壁和血管外，增加平滑肌肌层厚度和促进新血管形成，引发气道重塑［12-14］。MMP-9能刺激转化生长因子β1（TGF-β1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等生长因子的释放，促进上皮下成纤维细胞的增殖分化而参与气道重塑［15］。TIMP-1通过与MMP-9发生特异性结合而抑制MMP-9的活性，阻碍细胞外基质的降解，使其在气道内过度沉积而引起气道壁增厚，进而导致气道重塑［16］。

平喘颗粒是黑龙江中医药大学自制的中药制剂，由淫羊藿、太子参、黄芪、五味子、知母、炙麻黄、款冬花、罂粟壳、地龙组成。方中淫羊藿、炙麻黄共为君药，具有温补肾阳、宣肺平喘之功；黄芪、太子参、五味子、款冬花、地龙共为臣药，具有益气助阳、润肺生津、止咳平喘之功；罂粟壳敛肺止咳，为方中之佐药，酸涩收敛，可防君药辛散耗气；知母润肺止咳，引方中诸药归经，为方中之使药。方中补阳之剂配伍补阴之品，使阳得阴助而生化无穷，药物配伍收敛并用，升降有序，虚实同治，与哮喘阳虚痰盛之病机相合，诸药合用共奏温阳益气、化痰平喘之效。本实验应用OVA致敏液制备慢性哮喘小鼠模型，哮喘组小鼠肺组织可见气管壁和气道平滑肌明显增厚，管腔狭窄，上皮组织增生、脱落，黏膜肿胀、充血，且气道周围可见较多的蓝色胶原纤维组织等病理改变，WAm/Pbm、WAt/Pbm均明显增高，表明哮喘模型制备成功，模型组小鼠存在气道重塑。研究结果显示，与哮喘组相比，平喘颗粒组和普米克令舒组小鼠气道病理结构改变和胶原沉积均明显减轻，WAm/Pbm、WAt/Pbm明显下降，且肺组织中MMP-9和TIMP-1的表达水平明显下降。

综上所述，平喘颗粒可以减轻哮喘小鼠肺组织病理学改变，改善气道重塑，其机制可能与抑制MMP-9和TIMP-1的表达有关。本文探讨了平喘颗粒治疗哮喘气道重塑的作用机制，但哮喘是一种多因素、多机制引发的复杂病症，且中药复方成分多样化，可以通过多靶点、多途径、多环节发挥治疗疾病的作用，故我们今后仍需要大量的实验研究去探索更加深入，更加全面的作用机制，为临床的应用奠定基础。