基于网络药理学与分子对接技术探究半夏-夏枯草药对治疗高血压的分子机制∗

张泽宇 张 芯

（浙江中医药大学，浙江 杭州 310053）

近年来，我国高血压病的患病率不断上升［1］，2017年美国心脏协会将高血压的标准调整为≥130/80 mmHg，按此标准，我国成年人高血压的患病率或将达到46.4%，患病人数可能超过5亿人［2］。半夏配伍夏枯草常用于高血压病、失眠和甲状腺功能亢进等病症的治疗［3-5］。相关研究表明，半夏具有抗炎和保护血管内皮的作用［6］，夏枯草可通过降低血管紧张素Ⅱ和内皮素-1等含量发挥降压活性，且作用持久［7］。但中药多成分多靶点的特点，仍然是系统研究半夏-夏枯草药对药效物质和作用机制的一大困难。

网络药理学通过构建“药物-靶点-疾病”的相关网络，可以分析出中药的成分与疾病多靶点之间的相互作用，从而在整体上预测其活性成分及作用机制［8］。分子对接技术是通过计算机模拟，预测靶点与药物分子之间的结合模式与亲和力的一种方法［9］。本文将通过网络药理学，筛选出半夏-夏枯草药对的作用靶点，通过聚类分析预测其核心化合物，进而使用分析软件对靶点进行信号通路分析与分子对接研究，预测治疗高血压的作用机制，为其治疗高血压的临床和实验研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 半夏-夏枯草药对活性成分和作用靶点获取 利用 TCMSP 数 据 库（http：//tcmspw.com/tcmspsearch.php），以“半夏”“夏枯草”作为关键词，设置口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18，筛选半夏-夏枯草药对所含化合物成分并获取其作用靶点。

1.2 半夏-夏枯草药对高血压相关靶点的收集 通过 genecards数据库（https：//www.genecards.org/），以“Hypertension”作为关键词进行检索，将所得靶点根据Relevance score值降序排列，选取前400个作为疾病靶点。并用Venn工具将其与半夏-夏枯草药对作用靶点进行交集比对，得到“药物-疾病”共同作用靶点。

1.3 化合物-靶点网络的构建 通过Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-化合物-靶点”网络，将其作用关系进行网络拓扑学分析并可视化。以靶点度值（Degree）和中介中心度（betweenness centrality）评价半夏-夏枯草药对有效成分及靶点的重要程度，从而探究半夏-夏枯草药对中所含化合物的药理作用机制。

1.4 蛋白互作（PPI）网络的构建 用UniProt（https：//www.uniprot.org/）数据库将“药物-疾病”共同作用靶点的靶点名称转换为基因名称，并将基因名称上传至STRING11.0（https：//string-db.org/），输出PPI蛋白互作网 络 图（protein protein interaction network，PPI net⁃work），根据分析结果统计靶点蛋白关联频次，获取蛋白互作信息进行研究，筛选出核心靶点。

1.5 KEGG通路富集分析 利用Bioconductor数据库（https：//www.bioconductor.org/）对核心靶点进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Enclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析并将结果可视化。

1.6 成分-靶点分子对接 将靶点蛋白和化合物分子的pdb文件用AutoDockTools处理后保存为pdbqt格式的文件备用。将处理好的化合物与靶点蛋白，载入AutoDock Vina进行对接，使用Pymol，Ligplus软件对结果进行分析与可视化。

1.7 “成分-靶点-通路”网络的构建 取KEGG通路富集分析结果中排名前20的通路，结合文献，筛选出7条与高血压相关的通路。将活性成分、靶点、通路导入Cytoscape 3.7.2软件，得到“成分-靶点-通路”网络图。

2 结果

2.1 半夏-夏枯草药对活性成分的筛选结果 见表1。根据设置的筛选条件，在TCMSP数据库中筛选出半夏的活性成分11个，夏枯草的活性成分11个。β-谷甾醇，植物甾醇为两者共同活性成分。

表1 半夏-夏枯草药对的活性成分

2.2 半夏-夏枯草药对治疗高血压的靶点预测 利用genecards数据库对高血压靶点进行检索和排序筛选，最终得到400个与高血压相关的靶点，通过Venny工具与半夏-夏枯草药对中活性成分作用靶点进行交集比对，得到半夏-夏枯草药对治疗高血压的“药物-疾病”共同作用靶点54个，即为半夏-夏枯草药对治疗高血压的潜在靶点。图1为“药物-疾病”的韦恩图；表2为靶点信息。

表2 半夏-夏枯草药对治疗高血压的潜在靶点信息表

图1 半夏-夏枯草药对靶点与高血压靶点的韦恩图

2.3 “药物-化合物-靶点”相互作用网络 “药物-化合物-靶点”网络总共含有454条边和211个节点，其中包括2个药物节点、20个化合物节点（其中β-谷甾醇，植物甾醇为共同活性成分）、189个靶点节点，如图2所示。

图2 半夏-夏枯草药对“药物-化合物-靶点”网络

2.4 潜在靶点蛋白相互作用网络分析 基于蛋白与蛋白之间相互作用关系，利用STRING数据库构建半夏-夏枯草药对潜在靶点蛋白的PPI网络图（见图3）。得到的PPI网络包含54个节点，741条边，平均Degree为27.4。根据节点的Degree值大小绘制出30个关键靶点蛋白节点的条形图（见图4）。其中白细胞介素-6（IL-6）、苏氨酸蛋白激酶（Akt1）、肿瘤坏死因子（TNF）的度值（Degree=48/45/44）较其他靶点蛋白高，说明这3个靶点在网络中发挥了关键的作用，是连通网络中其他靶点蛋白的桥梁。

图3 半夏-夏枯草药对潜在蛋白靶点的相互作用网络

图4 半夏-夏枯草药对治疗高血压的STRING网络关键靶点（排名前30）

2.5 分子对接结果与分析 利用AutoDock Vina软件，对靶点相互作用网络中degree值最大的3个靶点蛋白（IL-6、Akt1、TNF）与半夏-夏枯草药对中的4个相关活性成分进行分子对接，对接结果见表4，最低结合能表示化合物与靶点蛋白具的结合能力，结合能越小，代表两者结合的越好［10］。图5表示3个靶点蛋白与其各自对应活性化合物对接最好的组合，其中包括IL-6与 luteolin，Akt1与 luteolin，TNF与 quercetin。对接结果说明了半夏-夏枯草药对中活性成分和靶点蛋白之间具有良好的结合能力。

表3 靶点蛋白与活性化合物的对接结果

图5 IL-6与luteolin，Akt1与luteolin，TNF与quercetin的结合模式

2.6 KEGG通路富集结果与分析 利用Bioconductor数据库对“药物-疾病”共同作用靶点进行KEGG通路富集分析并将分析结果转化为气泡图。KEGG通路富集分析（图6）提示，糖尿病并发症中晚期糖基化终产物-糖基化终产物受体信号通路（AGE-RAGE signal⁃ing pathway in diabetic complications），流体剪切力与动脉粥样硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis），肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway），白细胞介素-17信号通路（IL-17 signaling pathway）等信号通路与高血压的联系更为密切。

图6 半夏-夏枯草药对潜在靶点的KEGG通路富集分析

2.7 “成分-靶点-通路”网络的构建与分析 将半夏-夏枯草药对治疗高血压的活性成分，靶点蛋白，分析筛选出的相关信号通路导入Cytoscape3.7.2软件，构建“成分-靶点-通路”网络图，将3者的关系可视化（见图7）。图中共有51个节点，149条边。“成分-靶点-通路”网络图体现了中药治疗疾病，具有多成分、多靶点、多通路的特点，作用机制复杂。

图7 半夏-夏枯草药对“药物-成分-靶点-通路”网络

3 讨论

中医学将高血压归于“眩晕”的范畴。朱丹溪在历代医家认识的基础上提出“无痰不作眩”的病机理念，指出“眩晕属痰者居多，盖无痰不能作眩也”［11］。高血压的证候研究结果显示其证候以肝阳上亢为主，兼夹痰浊、痰热、血瘀等［12］。半夏化痰散结，夏枯草清热泻火、化痰散结，两药配伍共奏清热、化痰、散结之功效，与高血压的主要证候良好契合。

本研究搜集了半夏-夏枯草药对治疗高血压的活性成分共计20个，其中槲皮素、山柰酚等具有治疗高血压的相关作用。根据文献记载，槲皮素能够抑制血管紧张素转换酶的活性，改善内皮血管舒张［13］，山柰酚可以增强血管内皮的非依赖性和依赖性舒张［14］。

PPI网络显示，半夏-夏枯草药对的活性成分主要通过作用于IL-6、Akt1、TNF 3个靶点发挥治疗高血压的作用。靶点蛋白IL-6在血管内的炎症反应与免疫反应中起着关键的介导作用，能促进血管平滑肌细胞DNA的合成及增殖，与原发性高血压有着密切的关系［15］。在特发性肺动脉高压中，Akt1信号联级参与远端肺动脉平滑肌细胞的增殖与迁移增强，具有无效Akt1编码基因的小鼠患有肺动脉高压的概率很低，Akt1活性强弱影响着特发性肺动脉高压的发病［16］。在原发性高血压的发病机制中，TNF-α通过细胞毒作用，导致血管内皮功能障碍，TNF-α影响着机体对血压的控制［15-17］。分子对接结果显示，半夏-夏枯草药对的活性成分与IL-6、Akt1、TNF有很好的亲和力，半夏-夏枯草药对所含化合物治疗高血压的生物活性需要进一步实验验证。

通过分析预测出的靶点和通路发现半夏-夏枯草药对治疗高血压，主要是通过影响晚期糖基化终产物-糖基化终产物受体（AGEs、RAGE）信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路等发挥作用。AGE与RAGE的相互作用，可能通过影响血管平滑肌细胞的增殖诱导血管肥厚，进而导致肺动脉高压的发生［18］。文献记载，较高的血流剪切力利于维持正常的血管内皮功能，减少内皮损伤因子分泌，保护血管内膜，有效防止高血压的发生［19］。肿瘤坏死因子可引起血管内皮损伤、促进血管平滑肌细胞的增殖、诱导IL-6的表达和释放，在高血压的发生发展中扮演重要角色［20］。有研究证明，IL-17的过表达将诱导全身内皮功能障碍与动脉高压［21］。

本研究利用网络药理学和分子对接方法，预测分析半夏-夏枯草药对的活性化合物、抗高血压的分子机制并发掘了潜在的治疗靶点，以期为下一步实验研究提供参考。