HPLC-ECD 法同时测定海洛因急性中毒大鼠不同脑区 中单胺类神经递质含量＊

陈园园，李锋，魏佳韵，李香豫，王丹， 燕瑾，王优美，3，徐鹏，3**，狄斌**

（1.中国药科大学，南京 210009； 2.国家禁毒委员会办公室中国药科大学禁毒关键 技术联合实验室，北京 100193； 3.毒品监测管控与禁毒关键技术公安部重点实验室， 公安部禁毒情报技术中心，北京 100193）

海洛因是滥用较早并且较为广泛的毒品之一。据《2019 年全球毒品报告》称，海洛因是南亚2016 年在10～75 岁人口中滥用最普遍的阿片类物质。在美国，2016 年吸食海洛因的人口为90 万，约占12 岁以上总人口的0.3%[1]。每年因吸食海洛因而致死人数不容忽视，据美国疾病控制中心统计，在美国从2013 年以来每年因吸食海洛因致死的人数呈现增长的趋势，并且在2017 年的致死人数达到了15 482[2]。因此加强对海洛因毒性的研究存在其必要性并且也可为对中毒患者的解救方法提供可能的新的研究方向。

单胺类神经递质是中枢神经系统中一类重要的信息传递物质，主要包括多巴胺（DA）、5-羟色胺（5-HT）和去甲肾上腺素等。尽管单胺类神经递质在药物成瘾过程中发挥着相当重要的作用[3-4]，但值得注意的是，这类物质在毒品中毒过程中的影响近年来已引起相关学者的关注。有研究表明长期吸食毒品会对脑内不同脑区产生神经损伤[5-6]，并且有多项研究表明在长期给予海洛因后，大鼠特定脑区的DA 含量在升高后会逐渐呈现下降趋势，其原因可能主要与神经损伤有关[7-8]。有文献称阿片类物质比兴奋剂毒性更强，阿片类物质如海洛因其毒性主要与脑内DA 及其代谢物浓度有关[9]。而2016 年3 月，美国食品药品管理局（Food and Drug Administration, FDA）发布了《药品安全通讯》，内容涉及多种阿片类镇痛药物与5-HT 毒性的关系[10]。

目前我国还没有开展海洛因急性中毒与单胺类神经递质之间关系的研究。本文通过建立并应用HPLC-ECD方法，首次对海洛因急性中毒大鼠伏隔核和纹状体两个脑区中的DA 和5-HT 含量同时进行了定量分析研究。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

HPLC-ECD，Antec Scientific 公司（检测器型号为DECADE Elite，自动进样器型号为AS 110，泵型号为AZURA P 6.1L）；3K15 型高速冷冻离心机（Sigma 公 司）；XS105DU 型电子分析天平（METTER-TOLEDO公司）；Milli-Q 超纯水系统（Merck 公司）。DA、5-HT标准品（Sigma 公司）；磷酸氢二钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠（分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司）；辛烷磺酸钠（色谱纯，北京百威灵科技有限公 司）；高氯酸（分析纯，天津市鑫源化工有限公司）；乙腈（色谱纯，Merck 公司）；海洛因由公安部禁毒情报技术中心提供，纯度为85%。

1.2 色谱条件

色谱柱：QUATTRO，C18反相色谱柱（2.1 mm× 150 mm, 3 μm）；流动相：磷酸二氢钠-柠檬酸-辛烷磺酸钠缓冲体系（90 mmol/L 二水合磷酸二氢钠， 50 mmol/L 一水合柠檬酸，1.7 mmol/L 一水合辛烷磺酸钠，0.05 mmol/L 二水合乙二胺四乙酸二钠）∶乙腈（94 ∶6, V/V），使用前经0.22 μm 微孔滤膜负压滤过，并超声脱气20 分钟；流动相流速为0.3 ml/min，进样量为20 μl，柱温为35 ℃；电化学检测器工作电极为玻璃碳电极，参比电极为银/氯化银（Ag/AgCl）电极，工作电压为0.8 V，灵敏度为10 nA。

1.3 组织裂解提取液和标准品溶液的配制

组织裂解提取液为0.10 mmol/L 高氯酸、0.20 mmol/L二水合乙二胺四乙酸二钠、0.01%（W/V）L-半胱氨酸的混合水溶液。标准溶液的配制用组织裂解提取液配制浓度为0.5 mg/ml 的标准品储备液，置于-20 ℃冰箱中保存。使用时用组织裂解提取液将标准品储备液稀释至所需要的线性最大浓度，再逐级稀释至所需浓度。

1.4 实验动物

雄性ICR 小鼠，18～22 g；雄性Sprague-Dawley 大 鼠，体重280～360 g。均购自北京斯贝福生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0010。

1.5 通过上下法计算海洛因小鼠皮下给药的半数致死量（LD50）

在AOT425 StatPgm 软件的指示下进行逐只给药，根据每只小鼠的阳性（死）或者阴性（活）情况决定下一只小鼠的给药剂量，最终通过对结果的计算得到小鼠皮下给药海洛因的LD50及95%置信区间。

1.6 海洛因中毒大鼠不同脑区脑匀浆的制备

将小鼠皮下给药所得的海洛因LD50数据根据实验动物给药换算表换算成大鼠皮下给药海洛因的，设置生理盐水对照组、1/2 大鼠LD50剂量海洛因组和大鼠LD50剂量海洛因组，每组6 只大鼠，皮下给药1 小时后处死，大鼠处死后迅速断头，剥取全脑，擦去表面血迹后放置于-20 ℃冰箱冷冻，30 分钟后取出，然后参照大鼠脑立体定位图谱，冰台上迅速分离纹状体、伏隔核脑组织，分别精确称重，每0.01 g 脑组织（湿重）加入1 ml 组织裂解提取液，冰浴下匀浆，高速冷冻离心机15 000 r/min 4 ℃离心20 分钟，取上清液用 0.20 μm 滤膜过滤后进行HPLC-ECD 检测分析。

1.7 统计学方法

通过AOT425 StatPgm 软件计算得到小鼠皮下给药海洛因的LD50以及95%置信区间。通过GraphPad Prism 8 软件进行数据处理，组间通过单因素方差分析（one-way ANOVA）进行比较，P＜0.05 表示有统计学意义。结果均以平均值±标准误（±s）表示。

2 实验结果

2.1 专属性

DA、5-HT 标准色谱图、脑匀浆样品色谱图分别见图1-A 和图1-B， 保留时间分别为7.358 和17.175 分钟。

图1 标准品（A）及大鼠脑组织匀浆样本（B）色谱图

2.2 线性范围

由于脑组织样本中本身含有所测物质，故无空白样本。本实验用组织裂解提取液将DA、5-HT 标准储备液稀释成标准曲线各点浓度，DA：0.5, 2, 8, 32, 64, 128 ng/ml；5-HT：0.5, 1, 2, 4, 8, 16 ng/ml。采用外标法定量，以样品峰面积（A）对浓度（C）进行线性回归。结果表明，以上物质在测定范围内线性关系良好，回归方程分别为：

DA：Y=0.582 63X-0.011 8 r2=0.999

5-HT：Y=0.643 79X-0.113 99 r2=0.999

2.3 检测限和定量限

按3 倍信噪比计算最低检测限；按10 倍信噪比计算最低定量限。DA 和5-HT 的最低检测限均为0.2 ng/ml；最低定量限均为0.5 ng/ml。

2.4 精密度

配制低、中、高3 种不同浓度的混合标准液，同一天内每个浓度连续进样5 次，计算峰面积的RSD，测得日内精密度；连续测定5 d，计算峰面积的RSD，测得日间精密度[12]。日内、日间精密度均小于5%，表明本方法精密度良好。结果见表1。

表1 DA、5-HT 混合标准品溶液日内、 日间精密度（n=5）

2.5 准确度

按0.01 g 脑组织（湿重）加入1.0 ml 组织裂解提取液的比例分别将10 只大鼠的伏隔核和纹状体组织混合匀浆，作为回收率试验用样品，然后不同组织匀浆液分别取出三份按照样品处理方法操作后进样分析，求出两种匀浆液中DA 和5-HT 的平均含量作为空白值，然后取同量上述匀浆液分别加入低、中、高3 种浓度的对照品溶液，每个浓度平分6 份，按照样品处理方法操作后进样分析，将加入对照品溶液后测得的浓度减去空白值，与对照品比较计算伏隔核和纹状体中DA 和5-HT 的回收率[13]。不同脑区DA 和5-HT 回收率均在80%～120%以内，回收率良好。结果见表2。

2.6 稳定性

样品处理方法与加样回收率实验相同，将处理好的样品于4 ℃存放，于0、1、2 和4 天进样分析，得稳定性结果。结果表明，处理好的样品4 天内于4 ℃存放，各组分含量无明显降低，稳定性良好。结果见 表3。

表表2 加样回收试验结果（n=6）

3 脑组织匀浆提取液4 天内稳定性结果（n=4）

2.7 小鼠及大鼠皮下给药LD50 结果

由AOT425 StatPgm 软件计算可得，通过皮下注射给药方式的小鼠海洛因LD50为281 mg/kg，95%置信区间为231～300 mg/kg。根据实验动物给药换算表换算得到大鼠皮下给药海洛因LD50为197 mg/kg，取值为200 mg/kg，并取大鼠皮下给药海洛因LD50剂量的1/2，即为100 mg/kg，根据此结果设置生理盐水对照组、1/2 大鼠LD50剂量海洛因组和大鼠LD50剂量海洛 因组。

2.8 大鼠皮下给药海洛因1 小时后不同脑区中DA和5-HT 含量变化

大鼠通过皮下注射给药方给予不同剂量海洛因 1 小时后，伏隔核和纹状体中的DA 和5-HT 含量产生了不同程度的变化。与生理盐水组相比，大鼠伏隔核和纹状体中DA 含量无论是给予大鼠海洛因LD50剂量，还是1/2 大鼠海洛因LD50剂量，在1 小时后都没有显著性差异，而5-HT 含量在给予两个剂量海洛因 1 小时后，在伏隔核[F(2, 18)=31.59, P＜0.000 1]和纹状体[F(2, 18) =17.65, P＜0.000 1]两个脑区均发生了显著性升高(P＜0.01, P＜0.001)，且呈剂量依赖性变化。结果见 表5。

表5 大鼠皮下给药海洛因1 小时后不同脑区单胺类神经 递质含量变化（n=6～9，±s）

表5 大鼠皮下给药海洛因1 小时后不同脑区单胺类神经 递质含量变化（n=6～9，±s）

注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，与生理盐水对比。

单胺类神经递质含量/（ng/0.01 g）脑区 给药剂量/（mg/kg）DA 5-HT生理盐水 59.95±3.96 2.68±0.36 100 58.79±7.04 10.12±1.36**200 61.63±5.30 17.73±2.38***生理盐水 70.28±7.21 1.53±0.24 100 111.60±16.82 12.08±2.50**200 94.20±16.99 18.34±3.45***伏隔核纹状体

3 讨论

海洛因的毒性通常与其作用机制有关。邱平明 等[8]发现经长期给予海洛因建立成瘾模型的大鼠纹状体中DA 含量没有升高反而发生下降，其原因可能与长期给药致使纹状体发生功能损坏有关。同时有研究表明DA 对DA 能神经元有毒性作用，其机制可能是由其自身氧化产生的自由基引起[16]，还有文献称阿片类物质毒性与脑内DA 及其代谢物浓度有关，它会促使DA 浓度升高后翻转下降，引起细胞氧化损伤甚至死亡，其原因是DA 的代谢会产生过氧化氢（H2O2）并通过一系列反应产生活性氧自由基，对细胞产生损害，DA 同时还会抑制线粒体的呼吸作用[9]。因此在长期给予海洛因后可能会使DA 含量一直处于较高水平而导致DA 能神经较为密集的脑区产生一定程度的 损伤。

单次吸食海洛因过量致死的原因常常是呼吸抑 制[14]，其急性毒性与神经递质相关的机制研究则较少。有研究表明海洛因可以较强地激动DA 能神经，而5-HT能神经只有大剂量作用下才会被激动[15]。5-HT 浓度过高常常会导致5-HT 毒性的产生，阿片类镇痛药物多因其能抑制5-HT 转运体再摄取与5-HT 毒性相关[17]。

值得注意的是，我们发现：在海洛因单次急性给药实验中，给药1 小时后给药组两个脑区中的DA 含量与生理盐水组相比较，均没有显著性差异，而5-HT 含量则有显著性升高，且与给药剂量呈正相关，其含量是生理盐水组的4～20 倍，极可能产生了5-HT 毒性。因此在急性中毒剂量海洛因的作用下，海洛因毒性是否与此时产生的高浓度5-HT 毒性有关值得引起关注。

海洛因的中毒致死可能与DA 和5-HT 含量变化存在某些关联，但是由于缺乏与海洛因相关的单胺类神经递质毒性致死的文献，且由于本实验只设定了给药1 小时后这一个时间点以及未能进行更有针对性的机制研究，该类神经递质在阿片类物质急性中毒中的具体毒性机制还有待于后续进一步研究验证。

4 结论

本文采用高效液相色谱串联电化学检测器建立了准确、灵敏、稳定的同时测定大鼠不同脑区中DA和5-HT的实验方法，并对海洛因中毒大鼠伏隔核和纹状体脑区中的单胺类神经递质含量变化进行了测定。首次发现海洛因急性中毒可剂量赖性的显著升高大鼠伏隔核和纹状体脑区内的5-HT 水平，其急性毒性作用的主要靶点可能与大鼠脑内的5-HT 系统有关。