新疆绝经后女性2型糖尿病LRP5基因rs3736228、rs3781586位点的基因多态性及突变与糖、脂、骨代谢关系的研究

王曦龄 李 军 李思源 高 群 王 双

1 新疆石河子大学医学院第一附属医院内分泌代谢科(石河子 832000) 2 新疆石河子大学医学院(石河子 832000) 3 上海杨浦区中心医院(上海 200000)

2型糖尿病(type 2 diabetes, T2DM)是由多种病因引起的一组以胰岛素抵抗、胰岛素分泌不足引起糖代谢紊乱、长期高血糖状态为主要表现的临床综合征[1]。T2DM 是一种具有复杂病因的综合症，其发病与种族人群、先天遗传及环境改变、膳食结构相关[2]。而糖尿病合并骨质疏松(osteoporosis，OP)近年来频繁出现在糖尿病合并慢性并发症患者的关注中。它以骨量降低、在持续病因影响下无法维持正常骨小梁等骨组织微结构、进一步加剧骨的脆性，造成骨折等意外事件为特征的全身代谢性疾病。这是老年人骨折最常见的原因。统计数据表明，骨质疏松发生率在老年人和绝经后女性中明显增高。其中，骨密度(BMD)下降是脆性骨折的主要原因[3]。在骨质疏松的众多致病条件中，遗传一直是国内外专家关注的重要因素[4]。近年来国内外专家致力于发现并研究骨质疏松症候选基因的推想与实验，同时，一部分研究结果提示了在原发性骨质疏松复杂的病理机制中，遗传因素即基因多态性或基因突变占有重要地位，证实基因多态性在原发性骨质疏松病因中起了重要作用[5- 6]。女性绝经后发生骨质疏松主要原因是卵巢衰老功能降低，雌激素分泌低水平，成骨细胞功能减弱或降低，破骨细胞数目增加，两者之间失去正常的平衡状态，加速成骨细胞凋亡，引起骨转移、骨吸收加强，造成骨量减少发展成骨质疏松。糖尿病作为一种由遗传和环境等复杂多因素相互作用而引起的物质代谢性紊乱疾病，国内外多项研究证实了糖尿病患者存在脂质代谢异常，并同时提出了糖尿病性骨质疏松症等亚临床疾病状态[7]。本研究将对新疆石河子地区2型糖尿病绝经后女性LRP5基因该两个位点基因多态性及突变与糖、脂、骨代谢关系，为新疆绝经后女性2型糖尿病合并骨质疏松的防治提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料与诊断标准

从新疆石河子地区2016年10月—2017年10月社区及住院的绝经后女性中选取入组对象，根据患者病史、糖耐量试验及骨密度测定结果分为四组：糖耐量正常与骨量正常组(A组)，糖耐量正常与骨量异常组(B组)，T2DM与骨量正常组(C组)，T2DM与骨量异常组(D组)。该研究在医学伦理委员会的监督下，入组人员皆签字知情同意文书后开展本实验。

其中T2DM的诊断标准符合1999年WHO推荐的诊断标准。BMD的判断标准符合1994年WHO推荐的诊断标准。血液标本及信息收集均获患者的知情同意。纳入无特殊原因绝经后、完全行事能力人、神志清、说话流畅的女性；排除患有特殊类型糖尿病及1型糖尿病及其他引起骨质疏松等疾病的女性。

1.2 研究方法

1.2.1 临床生化指标的测定：由实验研究员使用调查问卷形式记录入组对象的姓名、年龄、绝经年限、糖尿病病史、骨质疏松症及其他代谢性疾病病史，采用统一标准对研究对象进行身高、体质量、腰围、臀围等资料的测量并登记。按照体质量指数(body mass index, BMI),等于体质量除身高平方(kg/m2)得到体质量指数，及计算腰围与臀围的比值，得到腰臀比。

1.2.2 一般生化指标的测定：选取1管静脉血采用罗氏全自动生化分析仪(型号Modular DPP-H7600)测定： FPG 等糖代谢指标；测定TG、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)等脂代谢指标；测定血Ca、血P、ALP等骨组织代谢指标；同时，高压液相色谱法(HPLC)测定糖化血红蛋白(HbAlc)数值。双能X线吸收法测定腰椎1- 4及股骨颈骨密度(BMD)。

1.2.3 LRP5基因DNA提取：采用受试者外周血5 mL，提取DNA的步骤按照天根生化科技有限公司使用说明，全血基因组DNA提取试剂盒，- 80 ℃保存备用。

1.2.4 Sequenom飞行时间质谱法测定LRP5基因rs3736228、rs3781586多态性：首先在UCSC网站查阅到SNP数据库上关于LRP5基因该两个位点的碱基序列和长度。顺利完成引物设计是需要Assay Design 3.0 Software(Sequenom Mass 公司)生物技术对两个位点设计引物，(具体引物序列如下)。打开PCR检测仪，设置PCR各项步骤；使用Sequenom飞行时间质谱法测定LRP5基因rs3736228、rs3781586的基因突变情况。步骤：引物设计，PCR扩增反应，PCR产物纯化，单碱基延伸反应，上机检测。以下为具体引物序列：

rs3736228:上游引物(F):5′-AGTGCGATGACCAGAGCG- 3′

下游引物(R):5′-TGGTGGGACAGGATGGGTG- 3′

Rs3781586:上游引物(F):5′-CCGTAAGCAGAGGGGACATT- 3′

下游引物(R): 5′-ATGGCACTGCTGAGGTGACTGT- 3′

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1.1 组间基线情况的比较 A、B、C、D四组研究对象的年龄、绝经年限、体质量指数、腰臀比等一般观察情况，见表1。

表1 组间基线情况比较

与A组比较，B组及D组的年龄(B组P=0.046；D组P=0.001)及绝经年限(B组P=0.027,<0.05；D组P=0.006,<0.01)均大于A组，差异有统计学意义，一般基线资料不齐，故采用协方差分析除外年龄及绝经年限对以下结果的影响。

2.1.2 组间糖代谢、骨代谢、脂代谢生化指标的比较 经协方差分析后A、B、C、D四组研究对象的FBG、HbAlc、TG、HDL-C、LDL-C、Ca、P、ALP、L1- 4BMD、股骨颈BMD等各项观察指标，见表2。

表2 组间生化指标经协方差分析后的比较

组间糖、脂、骨代谢及骨密度(BMD)指标比较结果：与A组比较，C组、D组的糖代谢指标FPG(C组P=0.005；D组P=0.001)、HbA1c(C组P=0.001；D组P=0.001)水平较高；B组、D组中脂代谢指标TG(B组P=0.038;D组P=0.046)水平较低；B组、D组BMD(L1- 4)(B组P=0.001;D组P=0.009)、BMD(股骨颈)(B组P<0.001;D组P=0.003)水平较低。

2.2 LRP5基因rs3736228、rs3781586的基因多态性及基因突变分析

2.2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡吻合度检验：本研究中，与病例组相比，对照组人群更接近自然人群，故仅在对照组人群中进行遗传平衡检验。新疆石河子地区绝经后女性该两个位点基因型A组经过遗传平衡检验结果：rs3736228位点：χ2=0.629，P=0.427；rs3781586位点χ2=0.465，P=0.495。说明本研究所选择的研究人群能够代表目标人群，具有较好的人群代表性。

2.2.2 LRP5基因组间基因型及等位基因分布频率：新疆石河子地区绝经后女性该两个位点组间基因型及等位基因分布频率未发现统计学差异(P>0.05)。

2.3 LRP5基因突变与骨、糖、脂代谢的关系

2.3.1 不同组间LRP5基因rs3736228位点不同基因型之间代谢指标的比较：由于TT型的研究对象少，所以将TT型与CT型整合成TT/CT(突变型)后与CC型(野生型)比较分析。A组LRP5基因rs3736228位点基因型之间基线指标的比较(P>0.05)，基线齐同，具有可比性。A组，与CC型(野生型)相比， CT/TT型(突变型)甘油三酯(TG)降低(P=0.026)，BMD(L1- 4)降低(P=0.046)；其他各项代谢指标差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。C组LPR5基因rs3736228位点基因型之间基线指标的比较(P>0.05)，基线齐，有可比性。C组，与CC型(野生型)相比，CT/TT型(突变型)高密度脂蛋白(HDL-C)升高(P=0.003)，磷(P)升高(P=0.038)；其他各项代谢指标差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。B组中各项代谢指标差异无统计学意义(P>0.05)。D组中各项代谢指标差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 A组LRP5基因rs3736228基因型之间骨、糖、脂代谢指标的比较

表4 C组LRP5基因rs3736228基因型之间骨、糖、脂代谢指标的比较

2.3.2 不同组间LRP5基因rs3781586位点不同基因型之间代谢指标的比较：由于TT型的研究对象少，所以将TT型与GT型整合成TT/GT(突变型)后与GG型(野生型)比较分析。B组LRP5基因rs3781586位点基因型之间基线指标的比较(P>0.05)，基线齐，有可比性。B组，与GG型(野生型)相比，GT/TT(突变型)高密度脂蛋白(HDL-C)升高(P=0.038)；其他各项代谢指标差异无统计学意义(P>0.05)，见表5。A、B、D组中各项代谢指标差异无统计学意义(P>0.05)。

表5 B组LRP5基因rs3781586基因型之间骨、糖、脂代谢指标的比较

3 讨 论

依据最新的中国流行病学调查可知，国人糖尿病总患病率高达9.7%，平均每10个中国人便有1个是糖尿病患者。糖尿病合并骨质疏松症发病率已达到60%以上，该病受包括遗传、环境、吸烟、过量饮酒、低钙饮食等多种因素在内的影响，在发病趋势上存在随着年龄增加而增加的特征[8]。随着人口老龄化进程逐渐加速，年龄因素在骨质疏松症中的发生、发展的影响日益突出，老年人患病率显著增加，OP及骨质疏松性骨折已成为现代社会不可忽视的公共健康卫生问题。两者起病隐匿，无论是长期高血糖状态还是骨量降低，临床症状不明显，患者无法及时医院就诊，明确诊断，造成治疗延误错过最佳时机[9]。人类低密度脂蛋白受体相关蛋白5基因在染色体上的位置为11q12-13，LRP5基因表达产物为跨膜受体蛋白[10]，目前国内外多项研究证实LRP5基因与T2DM、OP相关，也有研究提出LRP5作为共受体参与WNT经典信号通路调节骨代谢的机制假设[11]。故国内外学者考虑将LRP5基因的多态性及突变作为参与2型糖尿病性骨质疏松症代谢性转导信号通路中备选基因之一[12]，而LRP5基因多态性及突变与2型糖尿病及2型糖尿病性骨质疏松症的研究在国内外报道尚不明确。

在探讨LRP5基因与T2DM及OP的关系中，通过高通量时间飞行时间质谱法检测，发现新疆石河子地区绝经后女性2型糖尿病LRP5基因rs3736228、rs3781586位点高频等位基因频率分别是：0.786和0.814，这与日本、韩国等亚洲蒙古人种保持一致，而与白种人却存在明显的差异性。同时，发现该两个位点基因型分组中野生型纯合子基因型最多，突变型杂合子基因型次之，突变型纯合子基因型最少。本研究中将对照组与病例组相比，糖耐量正常与骨量正常组人群更接近理想自然人群，故使用遗传平衡检验对照组人群的遗传性情况。本研究发现新疆石河子地区绝经后女性群体该两个位点基因频率和基因型频率的遗传规律基本符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。说明本研究所选择的研究人群具有相对稳定的遗传性，能够较好的代表目标人群。与正常对照组(即糖耐量正常伴骨量正常组)相比，T2DM伴骨量正常组、糖耐量正常伴骨量异常组、T2DM伴骨量异常组位点基因型频率分组无统计学差异(P<0.05)。研究结果提示，该两个位点的基因多态性可能与新疆绝经后女性糖代谢紊乱没有关联。但本研究发现LRP5基因该两个位点在绝经后女性中的基因突变可能与TG水平降低、HDL水平升高、P水平升高、BMD水平降低有关，进一步说明LRP5基因该两个位点的基因的突变可能与该地区人群中脂、骨代谢有关，参与了2型糖尿病患者脂代谢紊乱及合并OP的发生发展。

目前2型糖尿病合并OP是一种常见病、多发病，尤其是在绝经后女性中发病机制的研究尚不明确。本研究表明LRP5基因在糖代谢、骨代谢中扮演着重要角色，该基因rs3736228、rs3781586位点的突变在新疆石河子绝经后2型糖尿病女性中可能参与了骨质疏松、脂代谢紊乱的发生、发展，关于Wnt信号通路相关蛋白LRP5的基因多态性突变，在未来的实验研究中还需进一步扩大人群范围，全面筛查影响基因的其他因素，从而通过较为先进的实验室测量方法及完善的统计学分析来揭示LRP5基因多态性与疾病之间的关系，为糖尿病合并骨质疏松的防治提供新的理论依据。