肾透明细胞癌超声造影参数与肿瘤新生血管相关性研究

孟 夏，赵胜男，杨 冉，张秀娟，王 辉

(吉林大学中日联谊医院 超声科，吉林 长春130033)

肾细胞癌是最常见的肾脏恶性肿瘤，其中70%是肾透明细胞癌(ccRCC)，ccRCC是最具有侵袭性的亚型[1]。肿瘤血管形成是多数人类肿瘤生长和转移的关键因素[2]，ccRCC是高度血管化恶性肿瘤，微血管密度(MVD)和分化程度是预测病灶侵袭性的关键指标[3]。但由于现阶段缺乏无创性评价肿瘤新生血管MVD、分化程度的方法，无法无创、有效评估肿瘤恶性生物学行为，限制了非侵入性治疗ccRCC的发展。超声造影(CEUS)的微血管显像技术使脏器实质灌注和微循环实现可视化成为可能[4-5]。本研究通过免疫组化的方法确定肿瘤新生血管密度、分化程度，分析其与超声造影的相关性，从而实现超声造影无创性评价ccRCC的新生血管情况，促进无创性治疗的进一步发展。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月至2019年10月吉林大学中日联谊医院经病理证实的78例ccRCC患者，术后切片行WHO/ISUP分级，其中Ⅰ-Ⅱ级52例，Ⅲ-Ⅳ级26例，均符合病理专业诊断标准，患者超声造影前均未经药物及手术治疗，超声检查与手术治疗时间间隔小于14天。其中男性36例，女性42例，年龄28-79岁，平均(55.56±10.90)岁。病灶直径1.5-13.0 cm，平均(4.1±2.2)cm。纳入研究患者除外标准：(1)ccRCC外混有肾细胞癌其他组织分型(2)CEUS视频图像质量不能进行超声造影参数定量分析(3)ccRCC肿瘤组织样本不足以进行免疫组化(4)一侧肾多个病灶,或双肾病灶。(5)已发生转移后经全身治疗患者。该研究已获得当地伦理委员会批准，并在登记时获得每位患者书面知情同意。

1.2 方法

1.2.1超声造影检查及图像分析 利用常规超声与彩色多普勒选取显示肿块及周围肾组织的最佳切面，进行CEUS检查，使用Esaote MyLabTwice超声诊断仪，探头中心频率3.5 MHz。超声造影剂选用SonoVue，使用前注入生理盐水5 ml，充分震荡至乳白色液体后抽出1.5 ml，经患者肘部浅静脉团注，随之用5 ml生理盐水冲注。选择最佳切面后在低机械指数状态(MI 0.10)下进入超声造影模式，同时启动内置录像系统记录CEUS全过程，造影剂注入完成后进行计时，在成像采集过程中，患者被要求屏气，呼吸障碍患者被要求轻缓呼吸，如果可能的话长达30 s，以便实时动态地观察造影剂动脉相、静脉相(开始灌注至正常肾皮质内造影剂显示最强时所持续的时间定为动脉相，之后定为静脉相。动脉相提供了正常肾组织和病灶内血管分布数量和形态迂曲程度，静脉相提供了超声造影剂在正常肾组织和病灶内清除的信息[6-7])，持续观察 3-5 min，再录像、保存。

启动Qontraxt软件，动态回放观察造影全过程，先画出整个肾脏造影声像图，待整体参数成像出来后，分别勾画两个感兴趣区域(ROI)ROI1、ROI2。ROI1是超声图像上ccRCC肿瘤边缘最增强的部分，ROI2是肿瘤临近正常肾皮质。尽量保持ROI1、ROI2在大小和深度上一致。在描绘ROI时，尽量勾划出肿块中有造影剂充填的区域，排除掉没有意义的强化缺失区、钙化和肾被膜。测量进行多次，并计算平均值。绘制造影时间-强度曲线 (TIC)，记录TIC参数指标：(1)定量指标：达峰时间(TP)、峰值强度(PI)(2)定性指标：造影剂填充快慢、造影剂排出快慢(通过与临近肾皮质TIC上升支斜率对比评价填充快慢，通过与临近肾皮质TIC下降支斜率对比评价排出快慢)、增强均匀性(均匀性与否取决于图像是否有充盈缺损)、肿瘤假包膜完整性。超声造影及超声造影软件评估均由两名有10年以上超声经验的专家操作和解释，他们对病人的所有信息包括病理诊断均不知情。

1.2.2MVD与新生血管分化程度的分析 78例肿瘤组织标本蜡块，各制备4 μm厚切片2张，组织学切片用苏木精和伊红染色(H&E)。免疫组化的染色方法分别用鼠抗人CD34单克隆抗体、鼠抗人CD31单克隆抗体(罗氏生物技术开发有限公司)标记内皮细胞。CD34 、CD31以肿瘤血管内皮细胞膜表面出现棕黄色着色为阳性判断，并按照 Weidner 法[8]进行定量。即每例标本先于100 倍光镜观察，选择阳性细胞聚集明显较其他部位多的部位，可视为一个“热点”，但因为本研究要评估每例患者两个连续切片的CD31与CD34的差异性表达，所以要选择CD31染色片中血管最丰富的区域来定义热点。选择5个MVD 最高的视野于200 倍光镜下计算微血管数目，然后计算其平均值，得到ccRCC的平均MVD。因为CD31与CD34在分化与未分化血管上的表达异质性[9]，可通过抗CD31抗体染色的血管数值减去抗CD34抗体染色的血管数，来获得未分化血管在整个肾肿瘤中的比例(MVDcd31+/cd34-%=MVDcd31+-MVDcd34+/MVDcd31+)。中位数作为截断点，将患者分为高MVD组和低MVD组。组织标本的处理和分析由本医院的病理学专家完成。

1.3 统计学处理

应用SPSS 23.0软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差表示，两组间比较采用Mann-WhitneyU秩和检验；计数资料以频数表示，两组间比较采用卡方检验。ccRCC超声造影定量参数与微血管密度、分化程度相关性，采用Spearman直线相关分析，计算相关系数，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 微血管高低表达组超声造影定量参数对比

以中位数作为截断点，将患者分为高MVD组和低MVD组(CD34+MVD中位数为60.5/HP，CD31+MVD中位数为63/HP，CD31+/CD34-MVD%中位数为12.5%)。与低表达组相比，CD34+MVD、CD31+MVD高表达组PI,TP均较高，CD31+/CD34-MVD%高表达组PI,TP均较低，差异均有统计学意义(P<0.05)(见表1，见图1-2)。

表1 微血管高低表达组超声造影定量参数对比(均数±标准差)

图1 MVD低表达组超声造影表现 ①ccRCC肿瘤的常规和造影图像；②ROI1(肿瘤边缘增强最明显部位)；③ROI2(ROI2是肿瘤临近正常肾皮质)；④ROI1的TIC曲线；⑤ROI2的TIC曲线

图2 MVD低表达组免疫组化结果(×100) ①CD34单克隆抗体标记内皮细胞；②CD31单克隆抗体标记内皮细胞，箭头处为CD31+/CD34-(未分化血管)

2.2 ccRCC超声造影定量参数与微血管密度、分化程度相关性分析

经Spearman直线相关分析，ccRCC超声造影定量参数PI，TP与CD34+MVD，CD31+MVD成正相关，与CD31+/CD34-MVD%呈负相关(r>0，P<0.05)(见表2，见图1-2)。

表2 ccRCC超声定量参数与微血管相关性研究(相关系数)

2.3 ccRCC超声造影定性参数与微血管密度、分化程度相关性分析

与低表达组相比，CD34+MVD、CD31+MVD高表达组，超声造影剂灌注模式主要表现为快进模式，CD31+/CD34-MVD%高表达组，超声造影剂灌注模式主要表现为慢进，差异均有统计学意义(P<0.05)。超声造影增强均匀性、造影剂消退方式、假包膜完整性，在MVD高低表达组没有明显差异(见表3)。

表3 ccRCC超声定性参数与微血管相关性研究(病例数)

3 讨论

CCRCC是最常见的肾脏恶性肿瘤，发病率和病死率均较高，手术治疗是目前最有效的治疗方法，但根治性肾切除手术严重影响患者生存质量，部分切除术复发率和转移率均很高，5年生存率低，预后不良[10]。因此寻求非手术治疗，尤其是对ccRCC效果较好的抗血管治疗[11]尤为重要，如单克隆抗体贝伐珠单抗[12]等抗血管药物的应用越来越受到认可，但因缺乏非侵入性评估CCRCC肿瘤新生MVD、分化程度的方法，不能评估肿瘤的恶性生物学行为，限制了抗血管药物的临床应用。CT、MRI虽然也可用于无创性评估，但由于辐射、肾毒性和金属植入物等因素，它们的使用受到限制。本研究中我们利用超声血管造影分析软件定量、定性分析了78例患者超声造影征象。通过免疫组化的实验方法量化MVD，评价新生血管的分化水平，确定超声造影参数与肿瘤新生血管相关性。

超声造影定量参数PI为灌注峰值，与ROI内的平均血容量呈正比。TP为病灶内出现第1个造影剂微泡至到达灌注峰值的时间。TIC曲线的上升支斜率与下降支斜率，与组织灌注和清除的快速程度有关。与低表达组相比，CD34+MVD、CD31+MVD高表达组PI,TP均较高(P<0.05)，且CD34+MVD、CD31+MVD表达的高低与PI呈明显正相关。CD34+MVD、CD31+MVD高表达组，超声造影剂灌注模式主要表现为快进模式。研究表明，通过定性和定量超声造影参数，可以有效的评价肿瘤内部新生血管的MVD。

研究表明，ccRCC肿瘤内部有分化型和未分化型两种类型新生血管[13]。本研究利用CD31在两种血管均有表达，CD34主要在分化血管表达这种差异性，利用免疫组化的方法，量化了ccRCC新生血管中的未分化血管(CD31+/CD34-)。在本研究中CD31+/CD34-MVD%高表达组PI,TP均较低(P<0.05)，超声造影剂进入灌注模式主要表现为慢进的模式。周细胞覆盖率是反映血管成熟的重要标志，是抗血管治疗的重要靶点[14-15]，CD34+(分化血管)的血管的周细胞覆盖率高于CD31+/CD34-(未分化血管)的血管，所以未分化血管较分化血管更加不成熟。这些特点决定了未分化血管在形态学上表现为没有或管腔小，形态迂曲，故此时肿瘤内血管的形态多为距离较宽的、轮廓缺失、迂曲严重的新生血管。所以未分化血管比例高时，出现了增强不明显、造影剂在微血管网内停留时间较短等乏血供特点，造影剂进入模式多表现为慢进的模式。综上所述，超声造影不仅可以有效的无创性评估新生血管MVD，还可以评估新生血管的分化程度，这对于抗血管治疗等无创性治疗的发展，具有重要意义。

本研究的不足之处在于，虽然对于免疫组化染色的质量进行严格控制，选择了抗CD31抗体染色较好的热点，来计算未分化血管的数量，但这也可能使我们的MVD计数较其他文献计数较低。此外，研究的样本量较小，属于回顾性研究，所以我们的研究只是初步研究。未来的研究应该以前瞻性的方式进行，采用更大的队列来进一步验证我们的结果。

综上所述，应用超声造影参数定量和定性分析可以间接的反应ccRCC的新生血管微血管密度、分化程度，能够客观的反应肿瘤的恶性生物学行为，对于ccRCC的非侵入性治疗的发展具有重要的意义。