枸杞多糖通过 TGFβ1/ Smad3信号通路改善慢性心衰大鼠心肌纤维化

孟立立

(北部战区总医院 先心病科，辽宁 沈阳110016)

心力衰竭(heart failure,HF)是多种循环科疾病的终末阶段，临床表现为心室收缩和(或)舒张功能障碍，导致体循环瘀血、肺静脉瘀血以及多脏器灌注不足，引起的以循环障碍为主的症候群[1]。目前全球心力衰竭患者约2250万，其中我国心力衰竭患者比重较大，发病率约为0.9%-1.4%，且呈逐年增长趋势。因此有效针对其发病机制予以防治具有重要意义[2]。目前已知心室重构(ventricular remodeling,VR) 是CHF发生发展的主要病理变化，即心室肌细胞的纤维样改变，导致心室肌僵硬度增加，引起心室收射血功能障碍[3]。近年来研究发现枸杞子提取物——枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide LBP)具有抑制氧化应激、抗炎症反应、抑制肿瘤生长、调节糖脂代谢等多种生物活性。研究发现，LBP对盐酸异丙肾上腺素(IOS)导致的CHF大鼠心功能具有保护作用，但其作用机制有待证实，TGF-β是调节细胞生长、分化、凋亡的重要细胞因子，对细胞损伤和修复、免疫功能等具有重要作用[4]。目前已证实，TGF-β1 通路在心肌梗死后心肌细胞损伤修复及重构过程中发挥重要作用，Smads蛋白是 TGF-β1信号通路重要的下游调节因子，TGF-β1与其受体结合后磷酸化并激活Smads蛋白，后者可以发挥转录因子功能，调节相关细胞因子的基因表达，最终诱导纤维化[5]。本研究以慢性心力衰竭大鼠为研究对象，观察枸杞多糖对其心脏功能的改善作用，初步探讨TGFβ1/ Smad3 通路在其中的调控机制，为临床心力衰竭防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选取SPF 级雄性 SD 大鼠30只， 体质量250-300 g，由中国医科大学实验动物中心提供(生产许可证号：SCXK(辽)-2013-0001，使用许可证号：SYXK(辽)-2013-0007)，实验动物在符合相应资质与条件设施中饲养，以便充足食水供应并确保自由取食，光照等环境条件模拟自然情况。根据中国医科大学实验动物管理委员会要求，所有实验动物均需适应性饲养7天，构建CHF大鼠动物模型应用腹主动脉缩窄法，将模型构建成功的CHF大鼠随机分为心力衰竭模型组(CHF组，n=10)、枸杞多糖+心力衰竭模型组(LBP组，n=10)，另构建假手术组(sham组，n=10)。

1.2 慢性心力衰竭大鼠模型制备[6]

大鼠腹腔注射麻醉后，密切关注大鼠生命体征变化，避免麻醉过深引起呼吸抑制而死亡。将大鼠胸腹部备皮后仰卧位固定于无菌小动物手术台，常规连接监护仪，待大鼠生命体征平稳后术区消毒，左上腹纵行切开皮肤，逐层剥离肌层，充分暴露双肾及腹主动脉，应用27G注射针头将双肾动脉远端约0.5 cm处与腹主动脉一同结扎，待拔出注射针头后，可实现主动脉狭窄约55%-60%，全程监测生命体征，最后逐层闭合腹腔。sham组大鼠区别在于暴露腹主动脉后不予以结扎。尽量保证在相同实验条件下建模，确保组间均衡。成功实验动物建模后予枸杞多糖溶液灌胃，枸杞多糖溶液滴定浓度为100 mg·kg-1，将该实验组归为枸杞多糖+心力衰竭模型组(LBP 组)，单纯心力衰竭模型组(CHF组)及假手术组(sham组)以同等剂量蒸馏水灌胃，各组持续给药时间8周。

1.3 超声心动图检查

枸杞多糖加心力衰竭模型组(LBP 组)、心力衰竭模型组(CHF组)及假手术组(sham组)实验动物药物干预处理结束后，采用乙醚吸入麻醉方式将实验动物麻醉，充分暴露大鼠胸部，超声心动仪选用飞利浦公司CX-50，探头型号为S-12-4，频率4-12 MHz。测定左心室舒张期末径(left ventricular internal dimension diastole LVDD)、左心室收缩期末径(left ventricular internal dimension systole LVDS)、左心室射血分数(Left ventricular ejection fraction LVEF)、左心室短轴缩短分数(Left ventricular short axis shortening fraction LVFS)。超声均由具有操作资质同一单人实施，各实验组测量结果连续测量3个心动周期，取平均值。

1.4 心脏标本采集与检测

各实验组在体干预及相关检查结束后处死大鼠，解剖并暴露心脏，通过右心耳入路，左心室注射预冷生理盐水灌流后，剥离心脏，擦干多余水份，剥离全心、右心室及左心室，分析天平分别称取质量并计算右心指数(right ventricular mass index，RVMI) 及左心指数(left ventricular mass index,LVMI)，最后取部分左心室心肌组织采用中性福尔马林溶液固定，部分置于-80℃冰箱中保存用于病理学实验以及免疫组化、免疫印记等进一步分子生物学实验。

1.4.1HE染色 取福尔马林溶液固定后的左室心肌组织，PBS溶液冲洗后，经梯度酒精脱水，透明、包埋、切片，贴片，烤片等常规程序，分别苏木精染色5分钟，1%盐酸酒精分色5 s，氨水冲洗反蓝1 min，蒸馏水冲洗30 s，经伊红染液30 s，PBS溶液冲洗后，封片光镜下观察。

1.4.2Masson染色 心脏组织脱蜡、脱水后置于Regaud苏木素液染5 min；梯度酒精脱水等流程封片，行光镜观察。

1.4.3Western blot 裂解心肌组织，匀浆，离心取上清，蛋白定量，行电泳、转膜，加入抗TGF-β1、 Smad3、p-Smad3、胶原蛋白 I、胶原蛋白 Ⅲ一抗，4℃冰箱中孵育过夜，加二抗，孵育。蛋白条带行吸灰度分析。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 心脏超声检查

超声心动图是临床上评价心脏功能及结构改变的常用方法，本研究收集各组大鼠心脏功能及结构参数来评价枸杞多糖对CHF大鼠心功能的调节作用，结果如图1所示，与sham组相比，CHF组LVDD、LVDS显著升高(P<0.05)，LVEF、LVFS显著降低(P<0.05)，提示CHF大鼠模型构建成功。经枸杞多糖干预后，心衰大鼠LVDD、LVDS显著降低(P<0.05)，LVEF、LVFS显著升高(P<0.05)，差异具有统计学意义，说明LBP可以改善CHF介导心脏功能障碍。

图1 各组大鼠 LVDD、LVDS、LVEF及LVFS 结果

2.2 LVMI及RVMI情况

RVMI、LVMI是评价心脏心室结构改变的重要手段，本研究称取各组大鼠全心、左室及右室质量，并计算各组大鼠RVMI及LVMI来评价各组大鼠心室重构现象，结果如图2所示，与sham组相比，CHF组RVMI、 LVMI均显著升高(P<0.05)，枸杞多糖可以显著降低RVMI、LVMI(P<0.05)，差异均具有统计学意义，这一结果与超声结果一致，均提示LBP可以明显改善CHF介导的心室重构。

图2 各组大鼠LVMI及RVMI结果

2.3 HE染色

HE染色观察心肌组织可见sham组大鼠细胞排列有序、规则，结构完整，未见明显细胞损伤；CHF组大鼠细胞肿胀，细胞边界模糊不清，心肌细胞损伤严重，与 CHF组相比，LBP组大鼠心肌细胞损伤程度明显改善。以上结果提示LBP可改善CHF诱导的心肌细胞损伤，见图3。

图3 HE染色结果(×200)

2.4 Masson染色

心机胶原蛋白沉积是导致心室僵硬度增加的主要病理因素，我们采用Masson染色观察各组大鼠心室肌纤维化程度，结果提示CHF组大鼠心肌组织中大量胶原纤维蛋白沉积，心肌纤维化程度较重；经LBP干预后，大鼠心肌组织中仅见少量胶原纤维蛋白沉积，纤维化程度较CHF组明显减轻，提示LBP可显著改善CHF大鼠心室肌纤维化程度，见图4。

图4 Masson染色结果(×200)

2.5 Western blot

TGF-β1/Smads信号通路是重要的纤维化调节因子，既往研究表明，TGF-β1/Smads通路激活会促进胶原纤维蛋白的沉积，参与心室重构的进展[17]。为明确枸杞多糖对CHF大鼠的调控机制，我们利用Western blot检测心肌组织中TGF-β1、Smad3、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ的表达，结果与sham组相比，CHF组大鼠心肌组织中TGF-β1、collagen Ⅰ和collagen Ⅲ 表达均显著升高(P<0.05)，Smad3磷酸化水平增强，而枸杞多糖可以显著下调TGF-β1、collagen I和collagen Ⅲ 表达，抑制Smad3磷酸化水平(P<0.05)，提示LBP能够改善CHF大鼠心功能，抑制心室重构进展，,其作用机制可能与抑制TGF-β1/Smads通路活性有关。

3 讨论

心力衰竭常发生于心血管疾病的终末期，可导致严重的循环功能障碍(circulatory dysfunction PICD)，异常的容量及压力负荷可导致心室结构及心肌顺应性改变，进而引起心脏射血功能及舒张功能障碍、心排血量减少，机体组织及细胞代谢功能紊乱。因此，预防VR的病理进展、提高心脏射血及舒张功能是改善HF患者远期预后的重要途径。本实验以压力负荷型CHF大鼠为研究对象，探讨枸杞多糖的调控作用，结果表明，LBP可显著改善CHF大鼠心肌纤维化进展，提高大鼠心功能，改善心肌细胞损伤，其作用机制可能与抑制心肌胶原蛋白沉积、抑制TGF-β1/Smads信号通路有关。

枸杞多糖作为枸杞子中的有效成分，具有清除自由基、增强氧化酶活性、减少氧化应激反应、提高机体抗氧化能力等功能[7]。有研究证实，在缺血缺氧条件下，LBP对心肌细胞损伤具有同样的保护作用。Lu等人以心肌缺血再灌注损伤(IR)大鼠为研究对象，观察LBP对大鼠心肌细胞损伤的影响，结果发现LBP可以显著降低IR大鼠心肌LD水平，提高Na+-K+- ATP酶和Ca2+- ATP酶活性，此外，LBP可显著下调Bax水平，抑制细胞凋亡，并呈剂量依赖性增加Bcl-2表达水平[8]。刘新岩等人利用LBP干预IOS诱导的CHF大鼠，结果发现，LBP可抑制CHF大鼠心肌纤维化进展[9]。由此可见，枸杞多糖对心血管疾病的发生发展有一定的预防作用。本研以CHF大鼠为研究对象，并予以LBP干预，结果发现LBP可显著改善CHF大鼠心脏收缩及舒张功能，减轻心肌细胞损伤，同时抑改善心室结构改变及心肌纤维化进展，推测LBP可以抑制大鼠心室重构进展并发挥心肌保护作用。

图5 各组大鼠心脏凋亡相关蛋白表达水平检测结果

细胞外基质的过量沉积、胶原纤维异常增生以及各型胶原比例失调是加速心室重构进展的重要病理机制之一[10-11]。胶原纤维维持心肌结构及功能的主要骨架，其主要包括Ⅰ型和Ⅲ型两种结构[12]。当纤维蛋白合成与降解平衡被打破后，胶原纤维化蛋白逐渐累积，室壁硬度增加、心室顺应性改变，进而导致心脏功能受损[13]。既往研究发现，心梗发生后，以Ⅰ型和Ⅲ型为主的胶原蛋白过量沉积，加速VR的进展，是导致心肌梗死后心功能改变的主要病理因素。CHEN等研究发现，慢性心力衰竭大鼠Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白过量表达与心功能改变呈负相关[14]。因此，有效清除过量的Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白沉积，是逆转VR的关键。本研究发现CHF大鼠心肌组织中collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白表达明显增高，这与上述研究结果一致，说明collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白异常沉积是导致心室硬度增加、引起心肌纤维化的主要原因，而LBP可显著下调CHF大鼠心肌组织中collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白表达，这与上述研究结果一致，均提示LBP对心衰大鼠心功能的改善作用可能与其抑制心肌组织中Ⅰ型和 Ⅲ 型胶原蛋白异常过量沉积有关。

TGF-β1作为重要的促纤维化细胞因子,主要参与调节成纤维细胞的增殖、转化、迁移、凋亡以及以胶原蛋白为主的细胞外基质的合成,同时具有诱导心肌成纤维细胞分化为有更强组织连接功能的肌成纤维细胞，促进心肌细胞纤维化进展。Smads蛋白是TGF-β1的下游信号分子,是唯一可以与TGF-β1结合的底物[15]，既往研究证实TGF-β1/Smads通路的激活在促进VR进展中发挥重要作用[16]。本研究发现CHF大鼠心肌组织中TGF-β1蛋白表达及Smad3磷酸化水平均显著升高，既往研究表明，TGF-β1通路的激活，可促进Ⅰ型和Ⅲ型纤维胶原蛋白的合成，同时增强氧化应激反应、加重细胞凋亡，共同引起心肌功能障碍[17]。这与本研究CHF大鼠心肌组织中collagen I和collagen Ⅲ蛋白高表达结果一致。同时，本研究发现LBP可显著下调TGF-β1表达，并抑制Smad3磷酸化，以上结果表明，LBP能够改善CHF大鼠心功能，抑制心肌细胞损伤,其具体机制可能与下调TGF-β1/Smads通路活性进而减少心肌组织纤维蛋白沉积、最终抑制心肌纤维化有关。