小檗碱预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤的影响

朱虹燕，王胜军，户占飞，3，宋健楠*，陈雪昭

(1.赤峰市医院 麻醉科，内蒙古 赤峰024000；2.赤峰学院附属医院 疼痛科，内蒙古 赤峰024005； 3.天津医科大学，天津300070；4.山西医科大学，山西 太原030001)

肝缺血再灌注是在肝移植，肝部分切除手术等中不可避免的生理过程，该过程可造成肝缺血再灌注损伤(HIRR)。大多数研究证明HIR引起的大量炎性因子的释放导致过度的炎症反应，氧化应激和细胞凋亡是导致HIRR的主要原因[1-2]。炎症小体是一种蛋白复合物，可以识别炎症反应的刺激，介导细胞焦亡[3]。小檗碱已被多个研究证实具有抗炎作用，可以减轻肝脏，心脏，肾脏，脑等的缺血再灌注损伤[4-7]。本研究通过建立大鼠HIR模型，探究小檗碱预处理对HIR的影响以及TXNIP/NLRP3炎症小体信号通路在该过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物分组与造模

SPF级SD大鼠，重200-250 g，购自斯贝福生物技术有限公司。于术前12 h开始禁食，不禁水。40只SD大鼠，采用随机平均分为4组，每组10只。(1)假手术组(S组)：每天用生理盐水4 ml灌胃2周后，仅行开关腹的处理；(2)肝缺组再灌注组(IR组)：生理盐水4 ml灌胃2周，开腹后用血管夹夹闭肝左、中叶的脉管，造成70%肝IR，建立大鼠热IR损伤模型；(3)小檗碱组(BBR组)：每天给予大鼠小檗碱溶液(100 mg·kg-1，用1%的DMSO溶解)4 ml灌胃2周后，建立大鼠肝脏热IR损伤模型；(4)1%二甲基亚砜(DMSO)组：每天给予大鼠体积分数1%的DMSO 4 ml灌胃2周后，建立大鼠肝脏热IR损伤模型。再灌注6 h后，处死大鼠，取血和肝脏组织。

1.2 血清学指标检测

应用全自动生化分析仪测定再灌注后6 h大鼠血清AST和ALT的水平，ELISA检测血清中IL-1β和IL-18。

1.3 细胞凋亡检测

按照TUNEL染色检测试剂盒的指示说明书进行操作。在×400倍放大倍数下，在三个随机的显微镜视野中计数凋亡细胞的数量计算凋亡指数。

1.4 免疫组化检测NLRP3表达

将肝组织标本石蜡切片脱蜡，水化处理，抗原修复15 min，用山羊血清封闭10 min，滴加一抗 NLRP3(1∶200)4℃冰箱孵育过夜，洗去一抗，滴加对应的山羊抗兔二抗(1∶2 000)，室温孵育 1 h，TBST 洗涤 3 次，每次5 min。滴加DAB显色观察拍片。

1.5 相关蛋白的检测

采用蛋白质印迹法(western blot)进行检测。提取肝脏组织蛋白质并进行BCA蛋白定量。配置适合浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，然后转膜。用5% 脱脂牛奶封闭1 h后，加一抗，4℃冰箱里孵育过夜。次日吸出一抗，用TBST洗膜3次；加入二抗，于室温下摇床孵育1 h，用TBST洗3次；加入显色液，X光片曝光、显影及定影，采用Image J图像分析软件测定蛋白条带的吸光度值。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 各组血清AST和ALT水平的比较

与S组相比，其余三组的血清AST和ALT水平明显上升，且具有统计学意义(P<0.05)；BBR组的血清AST和ALT水平较IR组和DMSO组则有明显下降趋势，且差异具有统计学意义(P<0.05)；IR组和DMSO组的血清AST和ALT水平则无明显差异(P>0.05)，见图1。

图1 各组血清AST和ALT水平的比较

2.2 各组血清IL-1β和IL-18水平的比较

与S组相比，其余三组的血清IL-1β和IL-18水平明显上升，且差异具有统计学意义(P<0.05)；BBR组的血清IL-1β和IL-18水平较IR 组和DMSO组则有明显下降趋势，且差异具有统计学意义(P<0.05)；IR 组和DMSO组的血清IL-1β和IL-18水平则无明显差异(P>0.05)，见图2。

图2 各组血清IL-1β和IL-18水平的比较

2.3 各组大鼠肝脏细胞凋亡情况

IR组和DMSO组，可见较多凋亡细胞，BBR组凋亡细胞明显减少，且差异具有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图3 各组大鼠肝脏细胞凋亡TUNEL×400

2.4 各组大鼠肝脏NLRP3表达情况

IR组和DMSO组，可见较多NLRP3阳性的细胞，且胞浆内染色强度较强，BBR组NLRP3阳性的细胞明显减少棕色染色强度也较弱，见图4。

图4 各组大鼠肝脏NLRP3表达情况 IHC×200

2.5 各组大鼠肝脏组织TXNIP/NLRP3信号通路蛋白的检测

相较于S组，其余三组的蛋白的表达含量均有所上调，且差异具有统计学意义(P<0.05)；与IR组和DMSO组相比，BBR组的蛋白的表达含量均有所下降，且差异具有统计学意义(P<0.05)，见图5。

图5 各组大鼠肝脏TXNIP/NLRP3信号通路蛋白的表达情况

3 讨论

目前大量的研究均表明在肝IR的过程中，过量的氧化应激反应，大量氧化自由基(ROS)的释放，以及炎性细胞的聚集是产生肝缺血再灌注损伤的主要原因[8]。有证据表明ROS可以使TXNIP 从细胞核内转位到细胞质，从而激活NLRP3 炎性小体[9]。TXNIP介导的NLRP3炎症小体的激活已被证实在多种器官缺血再灌注损伤中起作用[10-13]。近年来，大量研究表明TXNIP在缺血再灌注损伤中发挥着重要作用。TXNIP是α-抑制蛋白超家族之一，参与氧化应激介导的炎症反应[14]，起到促炎和促进细胞凋亡的作用。当细胞受到氧化应激刺激时，ROS增多，活化的TXNIP可以激活NLRP3炎性小体并促进炎性因子IL-1β、IL-18 从NLRP3炎性小体的释放[15-17]。细胞焦亡是新近发现的依赖于caspase-1的细胞程序性死亡方式，它不同于caspase-3依赖的细胞凋亡，以迅速的细胞膜破裂，大量炎性因子的释放为特征[18]。在我们的实验中，我们发现肝缺血再灌注后，TXNIP、NLRP3、ASC、caspase-1等炎症小体相关蛋白水平呈明显上升，与此同时血清中炎性因子IL-1β、IL-18 水平上调，免疫组化的结果也显示NLRP3炎性小体被激活。以上结果说明，在我们的大鼠肝IR模型中，TXNIP介导的NLRP3炎性小体信号通路被激活。

小檗碱是从黄连中提取的一种异喹啉生物碱，具有多种生物学效应。近来有研究发现小檗碱可以减轻巨噬细胞中NLRP3炎症体的激活，减少IL-1β的分泌[19]。本研究结果显示，给予小檗碱预处理后，与单纯IR组相比较，大鼠肝功能明显得到改善，细胞凋亡减轻，炎症小体相关蛋白水平则明显下降，与此同时血清中炎性因子IL-1β、IL-18 水平也下降，免疫组化的结果也显示NLRP3蛋白含量降低。以上结果说明了，小檗碱对于肝缺血再灌注的保护作用可能与抑制TXNIP/NLRP3炎性小体信号通路有关。

综上所述，小檗碱可以减轻大鼠肝缺血再灌注损伤，其机制可能与抑制TXNIP/NLRP3炎性小体信号通路有关。