柴胡龙骨牡蛎汤对精神分裂模型大鼠行为学及免疫系统的影响

孟祥杰，李自辉，庞牧，林佩锜，刘树民*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.马来西亚惠民中医药针灸治疗中心，吉隆坡 661000)

精神分裂症是一种严重的精神疾病，其病因尚不明晰。目前多采用西药治疗，但有一定不良反应，寻找一种理想药物对其进行治疗是当前的热点。中医学认为精神分裂症属于“癫狂病”的范畴，临床多表现为感知、思维、情绪、行为等障碍和精神不协调。柴胡龙骨牡蛎汤，原方载于《伤寒论》，在临床中多用于治疗精神神经疾病。庞伟[1]研究发现,柴胡龙骨牡蛎汤联合利培酮能提高精神分裂症患的治疗效果。周东丰等[2]研究发现,免疫异常可能在精神分裂症的发病机制中起关键作用，其存在免疫功能的紊乱，包括以细胞因子介导的免疫功能异常和体液免疫的改变，抗精神药物对细胞因子及抗氧化能力也有影响。本研究通过对精神分裂症大鼠行为学分析以及免疫和抗氧化能力进行测试，探讨柴胡龙骨牡蛎汤对精神分裂病症的相关影响。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

健康雄性SPF级SD大鼠60只，体质量(220±20)g，购自辽宁长生生物技术有限公司,许可证号：SCXK(辽)2015-0001。饲养于黑龙江中医药大学实验动物中心屏障系统内，室温(22±1)℃，湿度45%，适应性喂养7 d后进行实验。

1.2 药物与试剂

柴胡龙骨牡蛎汤药材饮片购自黑龙江中医药大学附属第一医院，药物组成中去铅丹。组方：柴胡12 g，龙骨4.5 g，牡蛎4.5 g，黄芩4.5 g，生姜4.5 g，人参4.5 g，桂枝4.5 g，茯苓4.5 g，半夏6 g，大枣6枚和大黄6 g。将上述药材于6倍量水中浸泡30 min，恒温加热进行提取，过滤，再加8倍量水提取，2次均冷凝回流1.5 h，合并药液，过滤，减压浓缩加工，得到水煎液，再经低温干燥机中冻干，得到冻干粉末，提取后计算其出膏率约为14.8%。

地卓西平马来酸盐(MK-801，美国Sigma公司，批号：M107-50MG)；利培酮片(西安杨森制药有限公司，批号：H20010309)；大鼠饲料(北京科澳协力有限公司，批号：2017041021)；注射用生理盐水(哈尔滨三联药业有限公司)；SOD、MDA、IL-2、IL-6、IFN-γ、IgG、IgM、TNF-α、NO试剂盒(南京建成生物工程研究所)；PKC ELISA KIT试剂盒(Cusahio Biotech，LTD批号：A21038680)。

1.3 仪器

AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；YP10001电子称(上海佑科仪器有限公司)；超低温冰箱(赛默飞世尔科技中国有限公司)；KDC-160HR台式高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)；Anthos2010酶标仪(奥地利安图斯公司)；MT-200 Morris水迷宫视频跟踪分析系统(泰盟公司)；旷场实验设备(北京金盛恒星医疗器械公司)。

2 方法

2.1 大鼠模型的制备

SD大鼠腹腔注射0.1 mg/kg的MK-801，每天1次，并于每日上午9时至10时完成造模工作，持续14 d。14 d后进行一般行为学评价，如果大鼠评价合格，则认定造模成功。

2.2 动物分组与给药

造模前，从SD雄性大鼠中随机选取10只作为正常组，对其余大鼠进行造模处理，将造模成功的大鼠随机分为模型组和柴胡龙骨牡蛎汤高、中、低剂量组及利培酮组。柴胡龙骨牡蛎汤高、中、低剂量组按人体临床上限剂量的4、2、1倍进行折算后给予柴胡龙骨牡蛎汤(即生药材11.2、5.6、2.8 g/kg)，利培酮组给予利培酮0.4 mg/kg；正常组和模型组给予蒸馏水10 mL/kg，持续14 d，每日称量大鼠体质量。

2.3 观察内容

2.3.1 一般特征观察

造模开始后，对各组大鼠进行详细观察，如大鼠的毛发、呼吸、运动以及大小便等，持续观察记录14 d。大鼠的一般行为学标准为:大鼠的活动是否正常、呼吸是否均匀，皮毛是否光亮，大小便是否正常。

2.3.2 刻板行为和共济失调

对大鼠的刻板行为和共济失调观察并评分，共6次，每10 min 1次，共观察60 min。对每只大鼠进行独立观察，并给予一个得分。根据盲法中的Sams Dodd和Hoff-man[3]标准，由2名实验员对其进行独立评定。每个行为测量的分数被确定为评级期间持续观察到的最高级别的刻板行为或共济失调，取其平均值。

刻板行为评分标准，0分：静止不动，很少或没有运动；1分：正常活动，偶尔向前运动；2分：伴随重复向前探索的活动；3分：持续向前探索；4分：反复抬头、摇头或旋转；5分：头部快速晃动、旋转或腹部背腹运动。

共济失调评分标准,0分：协调运动；1分：轻度摇晃，站立不倒；2分：中度不协调运动，偶尔会频繁跌倒；3分：无力支撑身体，爬行运动；4分：身体躺向一边或腹侧，不活动。

2.3.3 旷场实验

采用旷场实验设备评定，跟踪大鼠的活动，并自动计数。此试验在安静的房间内进行，将大鼠放入中心方格内，观察大鼠在10 min内的跨格总量，评价大鼠自主活动。

2.3.4 Morris水迷宫实验

在造模及给药后最后一天进行Morris水迷宫实验。首先将各组大鼠逐一放到水迷宫中，该水迷宫中没有平台，让其自由泳3 min，以此来帮助大鼠熟悉环境，然后进行水迷宫实验。逃避潜伏期设为60 s，每天从4个入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录它们发现隐藏在水下平台的时间(逃避潜伏期)，如果在设定的60 s时间内未找到平台，将其引至平台上10 s。持续训练5 min，每天3次。第4天为定位航行实验。随机选取入水点，并将大鼠放入水池中，对60 s内大鼠穿越原平台位置的次数、穿越原平台位置所在象限的次数以及停留原平台位置所在象限的时间进行记录。同时测量大鼠在原平台位置所在象限的游泳距离以及大鼠在所有象限中游泳的总距离，计算前者占后者的比，并将60 s内大鼠的游泳轨迹画出来。通过这一实验，考察大鼠对原平台的记忆。最后，根据水迷宫配套的摄像记录和EthoVision XT 10.1分析软件，对每次测得的数据进行统计和分析。

2.4 样品的制备

末次给药24 h后，用20%的乌拉坦将大鼠麻醉，腹主动脉取血，将其放置在常温下并静置40 min后，3 500 r/min离心10 min，取上清液，存放于-80 ℃超低温冰箱中备用。对冻存样本进行解冻处理，并根据酶联免疫检测法，严格按照试剂盒说明书上提供的方法操作，检测指标中相关含量。

胸腺指数(%)=胸腺重量(mg)/大鼠体重(g)×100%

脾脏指数(%)=脾脏重量(mg)/大鼠体重(g)×100%

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 大鼠一般特征表现

在造模数分钟后对大鼠的一般行为学进行观察，过程中大鼠没有死亡。正常组大鼠活动正常、呼吸均匀、皮毛光亮、大小便正常。模型组大鼠头部一直抖动，表现出四肢无力的现象，且不能正常爬行，喜欢咬尾巴，绕圈拖行，皮毛多呈竖立的状态，排尿增多，大便正常。利培酮组、柴胡龙骨牡蛎汤各组与模型组的大鼠行为相似。随着时间延长，模型组的大鼠依旧躁动不安、并且四肢舞动、饮食减少。利培酮组和柴胡龙骨牡蛎汤各组的大鼠则得到了不同程度地改善，四肢舞动情况好转，饮食恢复正常。

3.2 大鼠刻板行为和共济失调评分

结果显示，相较于正常组，模型组大鼠刻板行为和共济失调评分明显升高(P<0.01)。而柴胡龙骨牡蛎汤高剂量组、以及利培酮组与模型组比较，显著降低了大鼠刻板行为和共济失调评分(P<0.01)，见表1、图1。

表1 各组大鼠刻板行为、共济失调评价比较分)

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05。图1 大鼠刻板行为、共济失调评价(n=10)

3.3 大鼠旷场实验结果

结果显示，与正常组相比，模型组大鼠旷场实验跨格总量有了明显的升高(P<0.05)。相较于模型组，柴胡龙骨牡蛎汤高剂量组与利培酮组均降低了大鼠旷场试验跨格的总量(P<0.05)，见表2、图2。

表2 大鼠旷场实验跨格总量比较格)

图2 大鼠旷场实验跨格总量(n=10)

3.4 大鼠定位航行

结果显示，随着实验次数的增加，各组大鼠平均逃避潜伏期减少。相较于正常组，治疗前各组大鼠平均逃避潜伏期升高(P<0.05)；在治疗后，与正常组比较，模型组大鼠的平均逃避潜伏期明显增加(P<0.05)；与模型组比较，柴胡龙骨牡蛎汤高剂量组与利培酮药组大鼠平均逃避潜伏期出现明显减少(P<0.05)，见表3、图3。

表3 大鼠水迷宫定位航行平均逃避潜伏期比较

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05。图3 大鼠水迷宫定位航行平均逃避潜伏期(n=10)

3.5 大鼠空间探索

结果显示，经过训练的正常大鼠对原水下平台的位置一般均有所记忆。在搜索中，正常大鼠会在原平台位置附近搜索很多次，形成较多的穿越原平台位置的次数，停留原平台位置所在象限时间也更长，水迷宫轨迹图如图4所示。与正常组相比，模型组大鼠空间探索实验有明显差异(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较，柴胡龙骨牡蛎汤高剂量组与利培酮组大鼠空间探索实验出现明显差异(P<0.05或P<0.01)，见图4、表4、图5。

注：A：正常组；B：模型组；C：低剂量组；D：中剂量组；E：高剂量组；F：利培酮组。图4 柴胡龙骨牡蛎汤对精神分裂大鼠水迷宫轨迹图

3.6 对大鼠血清中IL-2、IL-6、IFN-γ含量的影响

从表5、图6可以看出，相比较于正常组，模型组血清中IL-2、IFN-γ的含量明显减少(P<0. 01)，IL-6的含量明显增加(P<0. 01)；相比较于模型组，柴胡龙骨牡蛎汤高剂量组与利培酮组大鼠血清IL-2和IFN-γ的含量明显升高(P<0.01)，IL-6的含量明显降低(P<0. 01)；柴胡龙骨牡蛎汤中剂量组血清IL-6的含量下降(P<0. 05)，IFN-γ的含量上升(P<0. 05)，差异具有统计学意义。

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，▲▲P<0.05，P<0.05。图5 大鼠水迷宫大鼠空间探索实验评价(n=10)

表4 大鼠水迷宫大鼠空间探索实验评价情况比较

表5 大鼠血清中IL-2、IL-6、IFN-γ含量的影响比较

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，▲▲P<0.05，P<0.05。图6 大鼠血清中IL-2、IL-6、IFN-γ含量的影响(n=10)

3.7 对大鼠血清中TNF-α与NO含量的影响

从表6、图7可以看出，与正常组相比，模型组TNF-α与NO的含量极明显升高(P<0. 01)；与模型组相比，柴胡龙骨牡蛎汤高剂量组与利培酮组TNF-α与NO的含量降低(P<0. 05)，差异具有统计学意义。

表6 大鼠血清中TNF-α与NO含量的影响

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，▲▲P<0.05，P<0.05。图7 大鼠血清中TNF-α与NO含量的影响(n=10)

3.8 对大鼠血清中免疫球蛋白(IgG、IgM)的影响

从表7、图8可以看出，相较于正常组，模型组血清IgG、IgM含量显著性减少(P<0. 01)；相较于模型组，柴胡龙骨牡蛎汤高剂量组与利培酮组大鼠血清IgG和IgM的含量明显升高(P<0. 01)；柴胡龙骨牡蛎汤中剂量组大鼠血清免疫球蛋白IgG含量升高(P<0. 05)，差异具有统计学意义。

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，▲▲P<0.05，P<0.05。图8 大鼠血清中IgG与IgM含量的影响(n=10)

表7 大鼠血清中IgG与IgM含量的影响

3.9 对大鼠血清中SOD、MDA的影响

由表8、图9可见，与正常组相比，模型组血清SOD含量明显减少(P<0.01)，MDA含量明显增加(P<0.01)；与模型组相比，柴胡龙骨牡蛎汤高剂量组与阳性药组大鼠血清SOD的含量明显升高(P<0.01)，MDA含量明显降低(P<0.01)；与模型组相比，柴胡龙骨牡蛎汤中剂量组大鼠血清MDA含量降低(P<0.05)，差异具有统计学意义。

表8 大鼠血清中SOD、MDA含量的影响

3.10 对大鼠胸腺及脾脏指数的影响

由表9、 图10可见，与正常对照组相比，模型组胸腺指数与脾脏指数有明显下降(P<0.01)；相较于模型组，柴胡龙骨牡蛎汤高剂量组与利培酮组大鼠胸腺指数与脾脏指数升高(P<0.05)，利培酮组大鼠胸腺指数与脾脏指数也升高(P<0.05)，均具有统计学意义。

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，▲▲P<0.05，P<0.05。图9 大鼠血清中SOD、MDA含量的影响(n=10)

表9 大鼠胸腺指数与脾脏指数的影响

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，▲▲P<0.05，P<0.05。图10 大鼠胸腺指数与脾脏指数的影响(n=10)

4 讨论

临床及动物实验研究表明，谷氨酸受体拮抗剂MK-801可诱导精神分裂症模型大鼠行为学的改变[4]。本研究以MK-801为精神分裂症的诱导剂，建立大鼠精神分裂症模型，发现MK-801诱导的精神分裂症模型大鼠出现刻板行为和共济失调，表现出与精神分裂症相似的的行为学改变。旷场实验，是将实验动物放置在新奇环境中，分析在该环境下动物的某些行为发生频率和持续时间，最终反应出被测试的动物在陌生环境中的自主行为和探究行为。其中各项自发性活动指标能够反映出大鼠的焦虑及精神不清样行为。通过刻板反应与共济失调结果，对精神分裂模型大鼠的状态进行最直接评价，模型组较之于正常组各项指标均明显降低，自发性活动明显减少；而较之于模型组，柴胡龙骨牡蛎汤高剂量组与利培酮组对以上各指标的改善作用均具有统计学意义，显示出两组对精神分裂模型产生的焦虑不安及神志不清症状均具有一定的改善作用。在水迷宫实验中，模型组的空间参考记忆较低，干预后柴胡龙骨牡蛎汤改善了这些认知能力，提示柴胡龙骨牡蛎汤能够有效改善大鼠精神分裂症的认知缺陷。

Schwarz M J等[5]研究发现,IL-2、IL-6、INF-γ以及免疫球蛋白(IgG、IgM)的生物学功能非常复杂，而且细胞的种类也比较多。在正常情况下，可以有效调节免疫应答，但是在病理状态下，其浓度的升高，会对机体产生免疫性的病理损伤，同时也会促进其他种类细胞因子的生成，直接影响多巴胺、SHIT和去甲肾上腺素的神经递质及下丘脑-垂体-肾上腺轴的激素，在精神分裂症的发病机制中占重要地位。此次研究结果表明柴胡龙骨牡蛎汤可调节精神分裂症大鼠体内IL-2、IL-6、INF-γ、IgG以及IgM水平，使之趋于正常，即改善精神分裂症大鼠的症状。TNF-α是一种主要由单核巨噬细胞产生的细胞因子，常与其他细胞因子共同参与机体生长发育和维持内环境稳定，其主要功能是调节免疫细胞，在免疫应答的调控和炎症的诱导等环节中起着关键作用[6]。李启欣等[7]研究也发现发病的精神分裂患者血清TNF-α高于正常对照组。本研究中，模型组TNF-α较其他组均有所增加，表明柴胡龙骨牡蛎汤可降低精神分裂症大鼠过高的TNF-α水平。NO作为体内的一种重要递质，用于细胞间传递信息，主要存在于心血管系统，神经系统以及免疫系统[8]。研究表明NO在神经系统中具有双向调节功能，可保护神经亦可对神经产生毒性。其中氧化型NO与N-甲基-D-天门冬氨酸受体(NMDAR)的琉基(SH)部分结合，导致NMDAR活性下降，通过抑制Ca2+内流进入细胞含量过高而产生毒性来保护神经功能[9]。而还原性NO可以使色氨酸、络氨酸等酶失活而阻碍细胞正常代谢，从而引起脂质过氧化造成人体损害[10]。本研究中，模型组NO含量较其他组均有所增加，组间有差异，提示柴胡龙骨牡蛎汤对精神分裂大鼠血清NO有调节作用。

聂红明等[11]研究发现SOD是机体内控制过氧化物水平的关键物质，该物质可以清除超氧阴离子自由基从而避免细胞过氧化物过多而引起的损伤。朱金华等[12]研究发现MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，在体内的含量可以反应出体内细胞的受损程度，是检测体内过脂质氧化水平的一项重要指标表。经研究发现，精神分裂患者血液中的抗氧化物质与脂质过氧化物指标异常，可能是由于过氧化物质积蓄过多导致神经中毒而功能异常，可能是精神分裂症发病的原因之一[13-14]。本研究中，柴胡龙骨牡蛎汤组较模型组SOD含量增多而MDA含量降低，表明柴胡龙骨牡蛎汤可提高SOD活性，抑制MDA生成，减少细胞损伤，减少氧自由基的累积。

胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，其中胸腺是T细胞分化、发育、成熟的地方，其功能与免疫密切相关；脾脏是机体发生特异性免疫的主要场所，产生大量淋巴细胞和巨噬细胞还可以制造免疫球蛋白和补体等免疫物质。胸腺指数和脾脏指数其数值高低可在一定程度上反应机体免疫功能的状态。胸腺和脾脏出现萎缩退化导致免疫功能降低，是精神分裂症的发病机制之一[15]。本研究结果表明柴胡龙骨牡蛎汤对改善精神分裂症大鼠胸腺和脾脏在机体中的比重有积极作用。

总而言之，柴胡龙骨牡蛎汤能显著提高精神分裂症模型大鼠共济失调，刻板反应及水迷宫测试中空间探索与定位分析的能力，改善精神分裂症模型大鼠的异常行为活动，促进其回到正常的行为习惯。调节精神分裂症模型大鼠血清中白介素、干扰素、免疫球蛋白、超氧化物歧化酶等含量，提高胸腺指数，脾脏指数。让机体免疫因子在一定水平保持稳定，并提高精神分裂大鼠的免疫功能。