化痰祛瘀法调控miRNA影响巨噬细胞抗动脉粥样硬化的分子机制研究

张永晨，秦合伟，赵平丽，周子朋

(1.驻马店市中医院，河南 驻马店 463000；2.河南中医药大学第二附属医院，河南 郑州 450002)

动脉粥样硬化(athcrosclerosis，AS)是冠心病、脑梗死和脑供血不足等缺血性心脑血管疾病的病理基础，脂质代谢紊乱和炎性反应是导致AS形成的主要原因[1]。研究发现小分子RNA-microRNA-467b可能参与了脂质代谢与炎症因子的调控[2-3]。有研究者发现miR-467b能够靶向调控脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase, LPL)，促进泡沫细胞形成、降低炎症因子表达水平及调控黏附分子水平，影响脂质沉积和黏附因子表达，引起AS的发生[4]。既往研究发现，化痰祛瘀法能够通过调节血脂、抗炎、保护血管内皮、抑制血小板聚集和调节免疫等作用，发挥抗AS的作用[5-6]，但化痰祛瘀法调节血脂、抗炎的具体分子机制还不明确。本实验通过观察化痰祛瘀法含药血清对miRNA-467b的调控，影响炎性因子分泌和巨噬细胞脂质蓄积，揭示化痰祛瘀法调节血脂、抗炎的具体分子机制，研究中医药抗动脉粥样硬化的内在分子机制。

1 材料

RAW264.7巨噬细胞株购自中国科学院上海生命科学研究所。化痰祛瘀法所用方剂血管软化丸药物组成包括：山楂30 g，神曲30 g，莱菔子15 g，陈皮12 g，清半夏9 g，茯苓15 g，连翘12 g，郁金12 g，枸杞子15 g，三七12 g，丹参12 g，珍珠30 g，代赭石30 g。中药饮片均来源于河南省中医院药剂科，根据要求浓缩成不同浓度的溶液(血管软化丸高剂量：浓度为3.456 g/mL；血管软化丸低剂量：浓度为0.864 g/mL)[5]。本研究所涉及的相关材料均通过本单位伦理委员会审查和批准。

2 方法

2.1 实验血清的制备

将30只雄性健康SD大鼠随机分为3组，每组10只，即高剂量组、低剂量组和对照组，分别给予血管软化丸86.4 g/(kg·d)、21.6 g/(kg·d)和等量的生理盐水灌胃，每日早晚2次，连续5 d，末次灌胃后1 h，麻醉取血，分离血清，0.45 μm微孔滤膜过滤除菌，分装，-20 ℃保存备用[5]。

2.2 细胞培养及分组

将RAW264.7巨噬细胞株细胞密度达到80%，弃去培养基，HBSS洗涤，去除培养基；0.25%胰酶消化5～10 min；弯嘴吸管稍用力均匀吹打下来，经过传代，取第3～5代巨噬细胞进行实验。

1)对照组：巨噬细胞+DMEM培养基；2)模型组：巨噬细胞+ox-LDL造模；3)miR-467b mimic组：巨噬细胞+ox-LDL造模后参照脂质体2000说明书转染微小RNA-467b mimic转染进入RAW264.7细胞；4)高剂量组：巨噬细胞+ ox-LDL+中药高剂量含药血清；5)低剂量组：巨噬细胞+ ox-LDL+中药低剂量含药血清。

2.3 建立巨噬细胞损伤模型

2.3.1 巨噬细胞活性检测

将巨噬细胞混悬液 (1×105cells/mL)，接种于6孔板中(30 000个细胞/孔)，37 ℃ 5% CO2培养箱培养，分别用不同浓度的ox-LDL (5、10、20、40、80 mg/L)培养液200 μL/孔，实验组为巨噬细胞加入浓度为5 mg/L的ox-LDL，同时设立正常对照组及空白对照组，正常对照组为巨噬细胞加正常细胞培养基，空白对照组只加培养基，不加细胞。采用酶标仪490 nm测定吸光度 (absorbance,A)值，并按照下列公式进行计算[7]。

细胞的存活率(%)=(实验组A值-空白对照组A值)/(正常对照组A值-空白对照组A值)×100%

2.3.2 巨噬细胞膜通透性检测

选取实验组(ox-LDL组)和正常组细胞，将巨噬细胞(1×105cells/mL)接种于6孔细胞培养板中，根据存活率实验结果，选择合适浓度的ox-LDL培养液2 mL/孔，细胞培养结束后用0.2%胰酶消化收集细胞，按试剂盒说明书对细胞进行染色，采用流式细胞仪检测实验组和正常组细胞的增殖和凋亡[7]。

2.4 血清干预巨噬细胞

细胞凋亡和增殖的检测：不同组别给予不同含药血清干预，按Hoechst33258试剂盒说明书染色，荧光显微镜下观察细胞形态并拍照，并用流式细胞仪检测细胞凋亡和增殖[7]。

2.5 巨噬细胞转染实验

在无菌条件下，用含有10% FBS的细胞培养基DMEM，将巨噬细胞(1×105cells/mL)接种于6孔板，每孔含有2 mL培养基，培养箱孵育备用；取miR-467b mimic 0.6 μL和HiPerFect转染试剂12 μL滴加入300 μL的不含FBS和抗生素的DMEM细胞培养基，混合均匀，使其终浓度为5 nmol/L；在室温条件下(15～25 ℃)，放置5～10 min，直至形成转染复合物；更换含ox-LDL(5 mg/L)的低糖DMEM细胞培养基培养孵育，等到巨噬细胞的融合度约达到80%时，终止培养，刮取细胞，以提取巨噬细胞的RNA和总蛋白[7]。

2.6 RT-PCR法检测RAW264.7巨噬细胞中pri-miR-467b mRNA、LPL mRNA表达

收集干预后和转染后的巨噬细胞，分离提取总RNA，进行RT-PCR反应，反应条件：94 ℃预变性；94 ℃ 50 s，55 ℃ 55 s，72 ℃ 60 s，72 ℃ 10 min共 30个循环[8]，根据PCR反应信号强度Ct值计算每个样本目的基因mRNA的相对表达量，引物序列见表1。

表1 pri-miR-467b、LPL的引物序列

2.7 Western blotting检测巨噬细胞中LPL蛋白表达

收集巨噬细胞，PBS洗涤3次，用试剂盒提取蛋白后，按步骤进行试验，使用Image J的软件分析条带灰度值，测定目的条带和内参照β-actin的灰度值，结果以样本灰度值/内参照灰度值表示[8]。

2.8 高效液相色谱(HPLC)法检测巨噬细胞内的胆固醇水平

用15 %KOH的醇溶液除去小鼠单核巨噬细胞样品中的甘油三酯，用6 %三氯乙酸除去其中蛋白质，然后以体积比为3∶2的正己烷与异丙醇混合溶剂提取巨噬细胞内的胆固醇，检测细胞内总胆固醇(total cholesterol, TC)、游离胆固醇(free cholesterol, FC)和胆固醇酯(cholesterol ester, CE)的含量[9]。

2.9 ELISA法检测培养基中炎症因子水平

取干预后细胞上清液，用酶联免疫吸附实验(ELISA法)测定细胞白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)、α-干扰素(TNF-α)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)水平，试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，严格按照试剂盒说明书操作。

2.10 统计学方法

3 结果

3.1 ox-LDL对巨噬细胞增殖和凋亡影响

选取5 mg/L浓度的ox-LDL干预巨噬细胞后，实验组巨噬细胞存活率为71.37%，正常组巨噬细胞存活率98.56%，差异具有统计学意义(P<0.05)。实验组巨噬细胞增殖率低于正常组(P<0.05)，实验组巨噬细胞凋亡率高于正常组(P<0.05)，表明造模成功。结果见表2。

表2 ox-LDL对巨噬细胞增殖和凋亡影响

3.2 血清干预和RNA-467b mimic转染巨噬细胞后细胞凋亡观察

干预和转染后，采用流式细胞仪检测，结果显示，与对照组相比，其他各组的巨噬细胞凋亡率明显高于对照组(P均<0.05)，而miR-467b mimic组和高剂量、低剂量组的巨噬细胞凋亡率均低于模型组(P均<0.05)，但高剂量组和低剂量组之间比较差异不明显(P>0.05)。结果见表3。

3.3 血清干预和RNA-467b mimic转染巨噬细胞后细胞增殖的形态观察

干预和转染后，采用流式细胞仪检测，结果显示，与对照组相比，其他各组的巨噬细胞增殖率明显低于对照组(P均<0.05)，而miR-467b mimic组和高剂量、低剂量组的巨噬细胞增殖率均高于模型组(P均<0.05)，但高剂量组和低剂量组之间比较差异不明显(P>0.05)。结果见表3。

表3 血清干预巨噬细胞后细胞增殖和凋亡检测结果

3.4 含药血清和RNA-467b mimic转染对巨噬细胞pri-miR-467b和LPL mRNA表达的影响

干预和转染后，RT-PCR法检测结果显示，与对照组相比，其他各组巨噬细胞pri-miR-467b mRNA表达明显低于对照组(P<0.05)，而miR-467b mimic组和高剂量、低剂量组巨噬细胞pri-miR-467b mRNA表达明显高于模型组(P<0.05)，但高剂量组和低剂量组之间pri-miR-467b mRNA比较差异不明显(P>0.05)。与对照组相比，其他各组巨噬细胞中LPL mRNA 表达明显高于对照组(P<0.05)，而miR-467b mimic组、高剂量组和低剂量组巨噬细胞中LPL mRNA表达明显低于模型组(P<0.05)，两组巨噬细胞中LPL mRNA比较差异不明显(P>0.05)，结果见表4。

表4 含药血清和转染干预对巨噬细胞pri-miR-467b和LPL mRNA和蛋白表达的影响相对表达量,n=6)

3.5 含药血清和RNA-467b mimic转染对巨噬细胞LPL蛋白表达的影响

干预和转染后，Western blotting法检测结果显示，与对照组相比，其他各组巨噬细胞中LPL蛋白表达明显高于对照组(P<0.05)，而miR-467b mimic组、高剂量组和低剂量组巨噬细胞中LPL蛋白表达明显低于模型组(P<0.05)，但高剂量组和低剂量组之间巨噬细胞中LPL蛋白比较差异不明显(P>0.05)，结果见图1，表4。

图1 含药血清和RNA-467b mimic转染对巨噬细胞LPL蛋白表达的影响

3.6 HPLC法检测巨噬细胞内的胆固醇水平

干预和转染后，HPLC法检测细胞内TC、FC和CE的含量，结果显示，与对照组相比，其他各组巨噬细胞内的TC、CE水平明显高于对照组(P<0.05)，而miR-467b mimic组、高剂量组和低剂量组巨噬细胞内的TC、CE水平明显低于模型组(P<0.05)，但高剂量组和低剂量组之间比较差异不明显(P>0.05)。与对照组相比，其他各组巨噬细胞内的FC水平明显低于对照组(P<0.05)，而miR-467b mimic组、高剂量组和低剂量组巨噬细胞内的FC水平明显高于模型组(P<0.05)，但高剂量组和低剂量组之间比较差异不明显(P>0.05)。结果见表5。

表5 含药血清和RNA-467b mimic转染对巨噬细胞内的胆固醇水平的影响

3.7 含药血清和RNA-467b mimic转染对巨噬细胞培养基中炎症因子的影响

干预和转染后，ELISA法检测结果显示，与对照组相比，其他各组巨噬细胞培养基中IL-6、IL-1β、TNF-α和 MCP-1水平明显高于对照组(P<0.05)，而miR-467b mimic组、高剂量组和低剂量组巨噬细胞培养基中IL-6、IL-1β、TNF-α和 MCP-1水平明显低于模型组(P<0.05)，高剂量组和低剂量组巨噬细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α和 MCP-1水平比较差异不明显(P>0.05)。结果见表6。

表6 含药血清和转染干预对巨噬细胞培养基中炎症因子的影响

4 讨论

动脉粥样硬化的发病机制主要有脂质浸润学说和炎症损伤反应学说。脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase, LPL)是水解血浆乳糜微粒和VLDL中甘油三酯的限速酶，LPL作为脂蛋白代谢的键酶，能够降低血浆甘油三酯水平并增加HDL-C水平，加速肝脏对脂蛋白的清除[10]。血浆中VLDL、LDL和脂蛋白残粒侵入血管壁沉积聚集，导致血管内膜的增厚和管腔的狭窄，另一方面，在多种因素的刺激下，泡沫化的巨噬细胞，导致大量炎症因子分泌，促进炎症细胞大量黏附、浸润和基质降解引起 AS斑块破裂[11]。脂质蓄积与炎症因子表达密切相关，两者相互促进、相互影响、协同作用，研究者采用siRNA干扰巨噬细胞中的LPL后，IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1等炎症因子分泌水平明显下调，该研究提示巨噬细胞中的LPL具有促进炎症因子分泌的作用[12]。

研究者还发现，当用ox-LDL处理巨噬细胞后，LPL与蛋白聚糖结合并以分子桥的作用促进ox-LDL大量进入细胞内，使得细胞内的胆固醇大量蓄积，IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1分泌大量增加，而RAW264.7巨噬细胞中转染miR-467b类似物或抑制剂后，发现miR-467b显著降低了脂质沉积和IL-6，IL-1β，TNF-α和MCP-1等炎症因子的分泌，进而起到防止巨噬细胞泡沫化的作用，这可能与miR-467b靶向调控LPL有关[12-13]。

基于前期大量的临床和实验研究，课题组认为动脉粥样硬化的病因病机与“痰浊”“血瘀”密切相关，痰瘀证候是AS的主要证型[14-15]，提出了化痰祛瘀的治疗大法。化痰祛瘀的具体方剂血管软化丸即依此组方，血管软化丸方中山楂消一切饮食积滞，为君药；神曲长于化酒食陈腐之积,莱菔子长于消谷物面食之积,半夏、茯苓健脾燥湿化痰,郁金、丹参、三七行气散结、活血化瘀,枸杞子滋补肝肾,珍珠母、代赭石平肝潜阳、降逆祛痰共为臣药；陈皮理气和中为佐药；甘草调和诸药为使。诸药合用，共奏消积化痰、活血化瘀之功，使痰瘀同治，血行痰清，气血流通[8]。既往临床研究发现，血管软化丸能够调节血脂代谢，调节血清炎性因子水平，改善血管内皮损伤，防治AS，此外血管软化丸还能够抑制颈动脉斑块形成，防治脑梗死[16-17]。动物实验研究发现，血管软化丸能够调控TLR9介导巨噬细胞极化效应，通过调控miR-33a影响ABCA1表达，抑制动脉粥样硬化的发生发展[18-19]。新近研究发现，血管软化丸能够调控CD40-CD40L系统调控血小板活化抑制动脉粥样硬化[6]，但血管软化丸调节血脂、抗炎的具体分子机制还不明确。

研究结果显示，化痰祛瘀法代表方剂血管软化丸的含药血清能够降低ox-LDL损伤模型的RAW264.7巨噬细胞凋亡率，提高巨噬细胞增殖率，能提高巨噬细胞中pri-miR-467b mRNA表达水平，降低巨噬细胞中LPL mRNA和蛋白表达水平，降低巨噬细胞内的TC、CE水平，降低巨噬细胞培养基中IL-6、IL-1β、TNF-α和 MCP-1水平；且高剂量组和低剂量组间比较差异不明显。本研究结果表明化痰祛瘀中药复方血管软化丸调节血脂、抗炎作用，抑制AS的分子机制可能与调控miRNA-467b，进而靶向LPL调控巨噬细胞脂质蓄积，减少 IL-6、IL-1β、TNF-α和 MCP-1 等炎性因子分泌有关，且不存在量效差异；本研究能够为AS和脂质代谢紊乱性疾病的防治提供实验依据，为中医临床客观诊疗AS提供科学依据和理论基础。