冠心病血瘀证对大鼠心肌能量代谢中关键酶的影响

冯宇，周曼丽，王健章，钱舒乐，张家齐，罗晓欣，兰晓栋，金梦雨，简维雄

(湖南中医药大学，中医诊断学湖南省重点实验室，中医心肺病证辨证与药膳食疗重点实验室，湖南 长沙 410208)

冠心病(Coronary heart disease,CHD)是冠状动脉病变引起管腔狭窄或阻塞，导致心肌缺血、缺氧后能量底物减少，ATP合成减少，葡萄糖、脂肪酸氧化失衡，心肌细胞形态受损，引起心肌功能异常，从而危害人类身体健康的疾病。有学者认为这是一种能量代谢性疾病，且有实验表明在血液循环中当血脂升高时，心肌能量代谢也已发生改变[1]。本实验前期证实能量代谢变化贯穿冠心病血瘀证这个由“血瘀证前期”向“亚血瘀证期”“心血瘀阻证期”流动的过程[2-3]。为进一步探讨在冠心病血瘀证状态下心肌能量代谢的调控规律，本次实验对冠心病血瘀证大鼠心肌能量代谢中关键酶的表达变化进行了研究。

1 材料与方法

1.1 动物

选取160只清洁级SD健康大鼠，雄性，体质量180～220 g。大鼠购自北京维通利华实验技术有限公司，在人工调控环境中饲养，相对湿度45%～70%，饲养环境温度22～26 ℃，自动灯光照明自上午8时至下午5时，自由饮食饮水1周后用于实验。

1.2 造模和分组

将160只大鼠分为空白组和模型组，其中空白组30只，用于制备动物模型组130只。参照以往研究基础进行动物造模和模型评价[2]，分3个阶段复制大鼠模型。

第一阶段，建立“血瘀证前期”大鼠模型。首先运用高脂饲养法复制高脂血症大鼠模型。将3%胆固醇、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%胆酸钠、10%猪油、5%白糖、81.3%基础饲料压制成高脂饲料，每天对大鼠进行饲喂。喂食7 d高脂饲料后，进行维生素D3溶液(50万IU/kg)灌胃，14 d后再进行维生素 D3溶液(20万IU/kg)灌胃。在造模第3周，选取10只空白组大鼠检测血脂和血液流变学指标，以空白组数值的95%参考值范围作为正常值。造模大鼠随机选取3只与空白组比较，血脂、全血黏度和血液流变学血浆黏度中的一项高于正常值，作为“血瘀证前期”模型成功标志。从中随机选取10只大鼠进行腹主静脉采血。在第一阶段造膜有5只大鼠死亡。

第二阶段，建立“亚血瘀证期”大鼠模型。在第12周，从第一阶段成模大鼠中随机选取3只大鼠，取主动脉进行HE染色检测，将大鼠血液流变学指标持续增高、主动脉动脉斑块形成作为模型成功的标志(10只“血瘀证前期”模型血液流变学数值95%参考值范围)。从中随机选取10只大鼠腹主静脉采血。同时抽取10只正常大鼠采集以上指标作为对照。在第二阶段造模有18只大鼠死亡。

第三阶段，建立“心血瘀阻证期”大鼠模型。在已建立的“亚血瘀证”大鼠模型基础上，参照文献方法进行造模：①用10%水合氯醛对大鼠进行腹腔麻醉(0.4～0.6 mL/100g大鼠)，同时记录标准Ⅱ导联心电图；②大鼠气管切开后接入人工呼吸机辅助呼吸(呼吸机的潮气量为8～12 mL，频率80次/分，呼吸比为1∶2),在第3～4肋骨间，距离胸骨左缘0.5 cm处作一约3 cm的纵行切口，从左侧第4肋间钝性分离皮肤、胸大肌、前锯肌，将胸腔打开，显出约1.2 cm的手术视野，将心脏暴露，剪开心包，在肺动脉圆锥与左心耳交界稍下1～2 mm处用无创伤缝线穿线，同时记录标准Ⅱ导联心电图；③结扎冠状动脉左前降支，同时记录标准Ⅱ导联心电图；以穿线而未结扎者作为假手术大鼠；以结扎部位以下心肌变白、搏动减弱且心电图出现ST段弓背向上明显抬高作为造模成功大鼠；④逐层缝合大鼠胸壁。第三阶段造模有31只大鼠死亡。

1.3 指标检测

运用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测柠檬酸合成酶(citrate synthetase,CS)、己糖激酶(hexokinase,HK)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的酶含量。操作步骤如下：

1)制备标本：各称取不同阶段的大鼠心肌组织，加入磷酸盐缓冲液(pH值为7.4)，在4 ℃条件下充分匀浆，2 000～3 000 r/min离心20 min，收集上清液。根据试剂盒上的步骤检测酶的浓度。

2)稀释加样标准品：按照说明书将标准品稀释成5个梯度。

3)加样：分别设置空白孔、待测样品孔，在酶标包被板上的待测样品中先加样品稀释液，再加待测样品。将一定稀释的待测样品加于酶标板孔底部，轻轻摇晃混合均匀。用封板膜封板后，置于37 ℃温育30 min，洗涤。

4)加酶标抗体：除空白孔外，于各反应孔中加入酶标试剂。37 ℃温育0.5～1 h，随后洗涤。

5)加底物显色：在各反应孔中先加入显色剂A，再加入显色剂B，摇晃混合均匀，37 ℃避光显色15 min。

6)终止反应：在各反应孔中加入终止液，终止反应。

7)测定：将空白组调零，450 nm波长依序测量各孔的光密度值(OD)。测定在加入终止液后15 min内进行。

1.4 统计学方法

2 结果

大鼠在冠心病血瘀证形成过程中心肌能量代谢酶的浓度变化如表1所示。血瘀证前期组与空白对照组关键酶浓度相比，CS、LDH浓度降低，HK浓度升高。亚血瘀证期组与血瘀证前期组关键酶浓度相比，CS、LDH浓度升高，HK浓度降低。心血瘀证期组与亚血瘀证期组关键酶浓度相比，CS、HK浓度升高，LDH浓度降低。

表1 各组心肌能量代谢关键酶含量的比较

3 讨论

冠心病的最常见证型为血瘀证，其基本病机为“心脉不通”。有研究发现冠心病血瘀证发病与心肌细胞能量代谢密切相关，其基本病理为心肌缺血[4]。心肌缺血引起心肌细胞氧供与氧耗失衡，导致葡萄糖无氧酵解增加、细胞酸中毒及乳酸堆积[5]。而能量代谢是疾病的一种反应形式，病情在变化，能量也随之变化。本课题组前期证实冠心病血瘀证是一个“血瘀证前期”→“亚血瘀证期”→“心血瘀证期”的流动过程[2]。因此，阐明心肌细胞能量代谢在冠心病血瘀证状态下的调控变化规律，有助于从整体上动态分析冠心病心血瘀证的形成过程和机理。

近年来，有许多研究证实在冠心病起始阶段的高脂血症时期，心肌的能量代谢就已受到影响。高红莉等[6]在研究中发现血液中脂质水平升高影响了心肌细胞结构，引起心肌ATP酶活性降低。谢益明[7]通过实验证明在高血脂状态下有异常的心肌能量代谢，心肌对能量底物的利用产生改变。由此可见，在冠心病血瘀证前期血脂开始升高时，心肌能量代谢已发生变化。在本实验心血瘀证前期组中，相较空白对照组CS、LDH浓度降低，HK浓度升高。CS是一种关键的代谢调节酶，可催化乙酰辅酶A和草酰乙酸合成柠檬酸盐和辅酶A，决定乙酰辅酶A进入三羧酸循环(TCA)的速率，在有氧代谢能量的产生中起着重要的作用[8-10]。LDH存在于机体组织细胞的胞质内，是参与糖酵解和糖异生中氧化还原反应的重要酶。在心肌组织代谢中，LDH催化乳酸为丙酮酸，从而为柠檬酸循环提供能量。HK是六碳糖的磷酸化酶，催化葡萄糖从稳定状态变为活跃状态的葡萄糖-6-磷酸，是糖酵解中的限速酶。在冠心病血瘀证前期，LDH、CS浓度降低，HK浓度升高。其原因可能是冠心病血瘀证前期血脂升高，脂肪酸代谢异常。正常心肌细胞脂肪酸摄取、利用平衡，高脂血症形成时，心肌细胞摄取、利用的脂肪酸增加，心肌摄入的脂肪酸超过其氧化能力，而脂肪酸的增加会激活蛋白激酶C，抑制葡萄糖的摄取、利用[11]。有研究发现在高脂肪饮食小鼠中会出现胰岛素信号缺陷，导致心肌葡萄糖利用减少[12]。

冠心病亚血瘀证期，大鼠主动脉斑块形成,动脉粥样硬化大鼠模型建立。LDH、CS浓度升高，HK浓度降低。动脉粥样硬化由脂质代谢紊乱引起，心肌脂肪酸β氧化增多，过量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)产生引起氧化应激。氧化应激是体内氧化与抗氧化失衡，通过氧化诱导内皮功能障碍，促进局部炎症[13]。Xu等[14]通过实验发现动脉粥样硬化斑块中内皮细胞的糖酵解水平下降。

冠心病心血瘀阻证期，大鼠出现心肌缺血、缺氧，HK、CS浓度升高，LDH浓度降低。无氧代谢作用的增强可能是机体受到缺血、缺氧的损伤而启动的代偿机制。心肌缺血、缺氧后，氧供与氧耗失衡，致使线粒体生成ATP减少，葡萄糖无氧酵解增加。LDH浓度降低，说明乳酸受催化形成的丙酮酸减少，乳酸利用减少导致其在细胞内堆积，使细胞内酸中毒加重。在正常心肌细胞内，控制内环境的稳定主要通过调节酶的活性来实现，特别是限速酶的调节。有研究显示在急性心肌缺血状态下，心肌能量代谢中对葡萄糖的利用率会上升[15-16]。当心肌缺血、缺氧后，葡萄糖摄取量和利用率增加，HK激活，糖酵解作用加速以提供有限的ATP，维持重要酶的活性。糖酵解重要的生理意义就在于当心肌缺血缺氧时，能迅速提供能量。线粒体是细胞中产生能量的细胞器，冠状动脉左前降支结扎后，氧含量降低会迅速导致线粒体功能障碍。CS浓度的升高可能是心肌细胞为改善线粒体功能增加对能量的需求。在蛋白-代谢组的关联性分析中发现在血瘀证重型组伴随着血液高凝状态及三羧酸循环加速[17]。

本实验研究了冠心病血瘀证大鼠形成过程中关键酶的动态变化，发现CS浓度先降低后升高，LDH浓度呈现“降低→升高→降低”的趋势，HK呈现“升高→降低→升高”的趋势。结果提示冠心病血瘀证形成过程中伴随着心肌能量的变化，从血瘀证前期就有三羧酸循环、糖酵解参与能量代谢。然而，本实验测定的酶有限，不能完整说明冠心病血瘀证形成过程中的心肌能量代谢，后期需结合更多能量代谢指标进行研究。