基于银纳米粒子-CdTe量子点复合物荧光探针检测水样和血清中L-半胱氨酸

占 鑫, 王秋月, 吴一微*

(污染物分析与资源化技术湖北省重点实验室,湖北师范大学化学化工学院,湖北黄石 435002)

L-半胱氨酸(L-Cys)作为小分子生物硫醇氨基酸,其作用是维持细胞或有机体中蛋白质的氧化还原状态。L-Cys水平的改变与肝损伤、皮肤损伤、帕金森等疾病[1]密切相关。因此,建立一种简单、灵敏、高选择性的新方法快速检测血清中L-Cys至关重要。

荧光光谱法[2]是检测L-Cys最常用的手段,具有选择性好、灵敏度高且测量方便的优点。但传统的有机荧光探针(罗丹明B)具有光谱带相对较宽,且不对称[3]等不足,限制了方法的选择性和灵敏度。为了获得稳定、高选择性的纳米复合物荧光探针,常采用硫醇分子或大分子作为封盖剂,形成保护层,从而避免量子点聚合猝灭,但这增加了量子点与猝灭剂/受体之间的距离,从而削弱了响应灵敏度[4]。为了解决这些问题,可以通过内滤效应(IFE)机制来设计基于纳米颗粒激活量子点荧光的复合物探针,这种机制不需要分子间相互作用，以及调整荧光团与猝灭物或受体之间的距离[5]。因此，开发基于IFE机制的新型量子点复合物探针检测L-Cys必不可少。

在本课题组前期工作中,开发了一种采用巯基乙酸(TGA)修饰的CdTe QDs作为荧光团,直接与银纳米粒子(AgNPs)复合的AgNPs/CdTe QDs探针用于特异性识别与检测H2S[6]。本文采用TGA修饰的CdTe QDs作为荧光团,与CQDs-AgNPs通过S-Ag键的结合,引发荧光猝灭效应,形成弱荧光的CQDs-AgNPs/CdTe QDs复合物探针,在加入L-Cys后,激发体系荧光恢复,据此建立灵敏的特异性检测血清和环境水样中L-Cys的新方法。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

LS45荧光光谱仪(美国，Perkin Elmer);U-3010分光光度计(日本，Hitachi);5700红外光谱仪(美国，Nicolet);PB-10 pH计(德国，Sartorius);90+/BI-MAS(美国，布鲁克黑文);Zeta-asizer(英国，Nano-Z,Malvern);X-ray diffraction(D/max-rC旋转阳极,Rigaku);JEM-2100透射电镜(日本，JEOL);FLS 980时间分辨分光镜(英国，爱丁堡)。

Cd(CH3COO)2·H2O,巯基乙酸(TGA),K2TeO3(上海化学试剂公司);L-半胱氨酸(L-Cys)(Aladdin);H3BO3(武汉江北试剂厂);H3PO4(开封东大化工有限公司);水为超纯水。

1.2 CQDs-AgNPs复合材料的合成

CQDs的合成[6]:将0.72 g葡萄糖溶于25 mL超纯水中,超声10 min后,转入50 mL圆底烧瓶,置入200 ℃真空干燥箱中密封反应2 h,得到淡黄色透明粘稠液体,自然冷却至室温,加入25 mL超纯水超声溶解后,4 ℃密封保存。

CQDs-AgNPs的合成[6]:分别将2 mL 10 mmol/L的AgNO3溶液,2 mL CQDs,4 mL 0.1 mol/L NaOH溶液,13.8 mL超纯水加入至三颈圆底烧瓶中,50 ℃、1 200 r/min磁力搅拌,避光反应30 min,制得亮黄色CQDs-AgNPs复合材料,4 ℃密封保存。

1.3 CQDs-AgNPs/CdTe QDs复合物探针的制备

CdTe QDs的合成[7]：将7.0 μmol/L CdTe QDs及200 μL CQDs-AgNPs混合，并溶解于625 μL 10 mmol/L的B-R缓冲溶液(pH=7.0)中,置于冰水中10 min后，4 ℃密封保存。

1.4 CQDs-AgNPs/CdTe QDs复合物探针用于L-Cys的检测

将上述制得的纳米复合物探针分别和不同浓度的L-Cys混合,再分别用10 mmol/L的B-R缓冲液(pH=7.0)定容至5.0 mL,反应12 min,用荧光分光光度计分别测定溶液在λem=555 nm处的荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 CdTe QDs的表征

CdTe QDs(λex/λem=458/555 nm) 溶液在365 nm紫外灯下可见黄绿色荧光(图1a);CdTe QDs的X射线衍射(XRD)峰位置与体积立方CdTe(blende锌)接近(图1b);CdTeQDs的透射电镜(TEM)(图1c)表明其粒径为2.4 nm;图1d是TGA和TGA-CdTe QDs的傅立叶红外(FT-IR)光谱图,可见O-H(3 440 cm-1),C=O(1 710 cm-1)特征峰移至短波长区间,S-H(2 600～2 500 cm-1)特征峰消失,表明TGA通过S-Cd键已成功修饰到CdTe QDs表面。

图1 CdTe QDs的表征：(a) CdTe QDs的激发和发射光谱;(b) CdTe QDs的X射线衍射图;(c) CdTe QDs的透射电镜图;(d)TGA和TGA-CdTe QDs的FT-IR光谱图Fig.1 Characterization of CdTe QDs:(a) Fluorescence excitation and emission spectra of CdTe QDs;(b) Powder XRD patterns of CdTe QDs;(c) TEM image of CdTe QDs;(d) FT-IR spectra of TGA and TGA-CdTe QDs

2.2 CQDs-AgNPs的表征

图2a紫外-可见吸收图谱表明CQDs-AgNPs复合物在波长396 nm处有一单吸收峰,且从红外光谱图(图2b)中可知，CQDs的红外光谱少了一个C-O-C吸收振动峰。

图2 (a)CQDs-AgNPs的紫外-可见光谱图;(b)CQD和CQD-AgNPs的和红外光谱图Fig.2 (a)UV-Vis spectrum of CQDs-AgNPs;(b)Infrared spectra of CQD and CQDs-AgNPs

2.3 CQDs-AgNPs/CdTe QDs复合物探针的组装条件优化

图3 CQDs-AgNPs/CdTe QDs纳米复合物探针的选择性Fig.3 Selectivity of CQDs-AgNPs/CdTe QDs probe

为使纳米复合物探针的组装过程达到最佳效果,优化了引起CdTe QDs猝灭的CQDs-AgNPs的体积及猝灭时间。结果表明,当CQDs-AgNPs的体积为200 μL时,CdTe QDs的荧光猝灭程度最大(猝灭效率为76%),且在10 min完成。因此,加入CQDs-AgNPs的最优体积为200 μL,最佳猝灭时间为10 min。

2.4 CQDs-AgNPs/CdTe QDs复合物探针的选择性

鉴于血清的基体复杂,分别考察了L-Cys、金属阳离子，抗坏血酸(AA)、组氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)、色氨酸(Try)、胱氨酸(Cys-Cys)、甘氨酸(Gly)、葡萄糖(Glu)与复物探针反应12 min后发射波长555 nm处的荧光强度。结果如图3所示,只有L-Cys较大程度地恢复了该复合物探针的荧光,表明其对L-Cys具有较好的选择性。

2.5 L-Cys对CQDs-AgNPs/CdTe QDs纳米复合物探针的荧光恢复响应时间及体系pH优化

实验探究了L-Cys对复合物探针在B-R缓冲液(pH=7.0)中的荧光恢复响应时间。结果表明,该探针在加入30 μmol/L L-Cys后,发射波长555 nm处荧光强度随着时间(0～12 min)的增加逐渐激活并恢复,在12 min时荧光恢复程度达到最大,并在12～16 min处形成一个稳定的平台。实验还分别探究了不同pH值对该探针荧光强度的影响,以及在L-Cys存在下,不同pH值对其荧光强度恢复的影响。结果表明,在pH=7.0时能最大程度地恢复纳米复合物探针的荧光强度。综上,选择荧光恢复最佳时间和pH分别为12 min和7.0。

2.6 分析性能

在最佳条件下,探究了CQDs-AgNPs/CdTe QDs与不同浓度L-Cys(0～40 μmol/L)反应12 min后荧光强度的变化。结果表明,复合物探针在发射波长555 nm处的荧光强度随着L-Cys浓度的增大不断增加,在浓度30 μmol/L时增加到最大,然后在30～40 μmol/L之后形成一个平台;在0.1～30 μmol/L的浓度范围内,荧光恢复程度与强度呈良好的线性：F/F0=0.075c+1.11(R2=0.9923),F0和F分别表示L-Cys加入前后荧光强度),检测限为32 nmol/L,相对标准偏差为2.6%。同时,与其他检测L-Cys方法[8-10]相比,本方法具有简单、灵敏、选择性好的优点。由于使荧光探针猝灭的因素太多，最关键的是此法能采用荧光恢复的方式检测L-Cys,大大降低了假阳性率。

2.7 CQDs-AgNPs/CdTe QDs纳米复合物探针对L-Cys的检测机理探究

如图4所示,CQDs-AgNPs中Ag+与CdTe QDs表面的S2-通过S-Ag结合,使CdTe QDs的表面形成缺陷,导致CdTe QDs荧光有很大程度地猝灭,形成弱荧光的CQDs-AgNPs/CdTe QDs复合物探针。随着L-Cys的加入,由于L-Cys中-S-与复合物探针中Ag+竞争络合,导致CdTe QDs辐射中心减少,同时活化了CdTe QDs的表面缺陷[11],使得CdTe QDs荧光得到恢复,从而实现对L-Cys的高灵敏、高选择性的检测。

图4 可激活CQDs-AgNPs/CdTe QDs纳米复合物探针检测L-Cys的机理图Fig.4 Mechanism of CQDs-AgNPs/CdTe QDs probe towards L-Cys

2.8 实际样品的检测

经过0.45 μm滤膜过滤的的水样来自黄石市青山湖,血清样品来自黄石第二医院检验科。在最佳条件下,采用CQDs-AgNPs/CdTe QDs复合物探针检测水样和血清中的L-Cys,并测试加标回收情况,以进一步验证方法的应用性能。结果如表1所示,该方法对L-Cys的回收率为97.4%～116.0%,相对标准差(RSD)小于3.0%,有较好的精密度和准确度,为临床研究测试血清中L-Cys提供新方法。

表1 血清中L-Cys的检测结果(n=3)

3 结论

本文通过碳量子点原位还原制备了以CQDs-AgNPs作为猝灭剂,巯基乙酸修饰的CdTe QDs作为荧光团,弱荧光的CQDs-AgNPs/CdTe QDs复合物探针。由于L-Cys中-S-与复合物探针中Ag+竞争络合作用,在L-Cys的激活下,CdTe QDs的荧光得到恢复,据此实现对水样和血清中L-Cys的准确检测。与传统荧光猝灭检测方法相比,本法采用荧光恢复的方式达到检测目的,这样假阳性率就大大降低,为医学分析提供了新的检测技术。