近红外Cu2+比率荧光探针合成及其细胞成像

袁跃华， 宋江涛， 鲍雅妍， 王艳艳， 张振国， 卫迎洁， 田茂忠*,2

(1.山西大同大学化学与化工学院，山西大同 037009；2.大连理工大学精细化工国家重点实验室，辽宁大连 116024)

微量铜对生物体是必不可少的，因为它在生物体的生理和代谢过程中起着非常重要的作用，包括自由基解毒、线粒体氧化磷酸化、神经递质合成和变性、结缔组织合成、色素形成和铁代谢[1]。因此，适量的铜有助于维持免疫系统和神经细胞的正常功能。生物体内铜的存在也有助于胶原蛋白的形成，而胶原蛋白是结缔组织和骨骼[2]的重要组成部分。然而，过多的铜会催化活性氧(ROS)的形成[3]，导致神经退行性疾病，如阿尔茨海默病[4]、门克斯病[5]、威尔逊病[6]。人体内缺乏铜也会导致许多疾病，包括骨髓发育异常、贫血[7]。因此，对食品、饮用水和活细胞中Cu2+的检测是非常重要的。

荧光法检测Cu2+因其具有高灵敏度、高选择性、原位实时检测、价格低廉等优点而成为一种很好的检测方法[8-10]。其中，近红外荧光探针对生物样品的光损伤小，且穿透组织较深，不易受到生物体自荧光的干扰，因此更有利于生物荧光成像[11,12]。此外，在复杂的生物体中，仅通过增加或减少荧光强度很难准确地检测被分析物的浓度。相比之下，比率荧光探针利用两种不同波长的光发射，消除了仪器、探针浓度、光漂白和微环境等引起的误差[13]。但是，有关近红外比率Cu2+荧光探针目前报道的还较少[14-18]。在本工作中，我们开发了一种新的基于罗丹明染料和菁染料衍生物的近红外比率Cu2+荧光探针，并成功地将该探针用于活HeLa细胞中Cu2+的荧光成像。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

Ascend400核磁共振仪，购自瑞士Bruker公司；Saturn 2200/2100质谱仪，购自美国Varian公司；F-2500 荧光分光光度计，购自日本Hitachi公司；Lambda35紫外光谱仪，购自美国PerkinElmer公司；R215型旋转蒸发仪，购自瑞士Buchi公司；pHS-25B型pH酸度计，购自上海大中分析仪器厂；SHZ-D循环水式真空泵，购自巩义市予华仪器有限公司。

探针RCy7标准溶液：准确称取一定量的探针RCy7，溶于二甲亚砜中，配制成1.0×10-2mol/L的贮备溶液，使用时根据需要适当稀释。金属离子标准溶液：准确称取一定量的各金属离子硝酸盐，溶于二次蒸馏水中，配制成5.0×10-2mol/L的贮备溶液，使用时根据需要适当稀释。通过HCl调节Tris碱的pH为7.2，配制20 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液。柱层析硅胶(200～300目)购自青岛Makall公司。罗丹明B购自百灵威试剂有限公司；2,3,3-三甲基吲哚购自阿拉丁试剂公司；溴己酸、乙二胺、环己酮和其它试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。所有试剂均为分析纯；水为二次蒸馏水。

1.2 探针的制备

探针RCy7的合成路线如下所示：

1.2.1 化合物2的合成化合物3、4、1按文献报道的方法[19,20]合成。将1.22 g(4.3 mmol)化合物4和0.36 g(2 mmol)化合物3加入50 mL的单口烧瓶中，再加入15 mL甲苯和35 mL正丁醇，然后在氮气保护下回流5 h，待生成的绿色溶液冷却后减压蒸去溶剂。用丙酮和甲醇重结晶粗产品得到483.1 mg绿色粉末化合物2(29.1%)。

1H NMR(500 MHz,CDCl3)：δH：8.33(d,J=14.0 Hz,2H),7.38(d,J=7.4 Hz,4H),7.25(d,J=7.4 Hz,2H),7.18(d,J=7.4 Hz,2H),6.25(d,J=14.0 Hz,2H),4.23(t,J=6.9 Hz,4H),4.03(t,J=6.9 Hz,4H),2.73(s,4H),2.32(t,J=7.4 Hz,4H),2.08(s,1H),1.99(d,J=5.2 Hz,2H),1.92～1.81(m,4H),1.72(d,J=7.7 Hz,15H),1.61～1.49(m,8H),1.34(dd,J=14.0,7.4 Hz,4H),0.91(t,J=7.4 Hz,6H)。13C NMR(125 MHz,CDCl3)：δC：173.45,172.41,172.30,150.34,147.83,144.26,142.20,141.10,141.04,129.44,128.84,127.57,125.34,122.27,110.94,101.84,101.47,64.24,49.37,49.33,44.74,33.91,30.63,28.13,28.08,27.63,27.20,26.64,26.47,24.60,20.75,19.11,13.69。

高分辩质谱(HRMS)(ESI)m/z:C50H68ClN2O4[M]+计算值：795.4862;实测值：795.4956。

1.2.2 荧光探针RCy7的合成将555 mg(1.147 mmol)化合物1和200 mg(0.229 mmoL)化合物2加入50 mL的单口梨形烧瓶中，再加入20 mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，然后在70 ℃下氮气保护搅拌反应，薄层色谱跟踪。待反应结束后，减压除去溶剂，把固体溶在2 mL的二氯甲烷中。用200～300目的硅胶柱色谱分离，洗脱溶剂为三氯甲烷/甲醇=30∶1,得到199.7 mg的深蓝色固体RCy7(63.8%)。

1H NMR(500 MHz,CDCl3)：δH：9.63(s,1H),7.91(d,J=5.9 Hz,1H),7.64～7.52(m,4H),7.34～7.30(m,2H),7.27(s,1H),7.17(d,J=5.9 Hz,1H),7.10(t,J=7.4 Hz,2H),6.90(d,J=7.4 Hz,2H),6.52(d,J=8.8 Hz,2H),6.41(s,2H),6.34(d,J=8.8 Hz,2H),5.63(s,1H),5.61(s,1H),4.08(t,J=6.6 Hz,4H),3.85(s,4H),3.48～3.54(m,4H),3.45～3.27(m,8H),2.50(s,4H),2.35(t,J=7.2 Hz,4H),1.90～1.76(m,6H),1.75～1.69(m,6H),1.59～1.61(m,15H),1.49(d,J=6.8 Hz,4H),1.36～1.40(m,4H),1.19(t,J=6.9 Hz,12H),0.94(t,J=7.4 Hz,6H)。13C NMR(125 MHz,CDCl3)：δC：173.52,170.43,169.00,166.91,153.88,153.46,149.10,143.09,140.10,137.12,133.45,129.95,128.56,128.29,124.28,122.81,122.65,121.78,119.39,108.58,108.39,104.11,98.01,94.19,64.29,52.43,47.51,44.46,43.09,42.12,34.03,31.94,30.66,29.71,29.37,28.63,26.66,26.31,26.03,24.67,22.70,21.11,19.14,14.13,13.72,12.65。

HRMS(ESI)m/z:C80H103N6O6[M]+计算值：1 243.7934;实测值：1 243.8485。

1.3 光谱测量

按照下面方法进行滴定实验：将10 μL的RCy7(5 mmol/L)溶液加到体积比为1∶1的乙腈/Tris-HCl(20 mmol/L，pH=7.2)缓冲溶液中，用微量进样器逐渐加入一定量Cu2+储备溶液。

选择性实验按照下面方法进行：在5 mL含RCy7(10 μmol/L)的缓冲溶液(pH=7.2)中，加入5 μL金属离子储备溶液，光谱分析前，室温下放置1 h。紫外-可见吸收光谱在300～800 nm波长范围内记录。荧光光谱在560～800 nm波长范围内记录，激发波长为550 nm，激发和发射狭缝为5.0 nm。

1.4 细胞成像

HeLa细胞购自中国科学院上海细胞库。将HeLa细胞铺于共聚焦培养皿，用DMEM培养基，37 ℃、5%CO2恒温箱培养，第二天待细胞贴壁后，以磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗3次，然后加入0.5 mL的DMEM和10 μmol/L的RCy7，在37 ℃下孵化1 h。为了除去残留的RCy7缓冲液，用PBS冲洗细胞3次，然后分两组，在一组中加入DMEM(0.5 mL)和50 μmol/L的Cu2+溶液，孵育细胞60 min后使用PBS洗去多余的Cu2+，然后在Leica TCS SP8共聚焦显微镜下观察细胞，并进行拍摄。采用552 nm的激光激发，接收波长范围分别为560～650 nm和680～800 nm。物镜采用630X油镜进行拍摄。

图1 探针RCy7(10 μmol/L)对Cu2+(0～100 μmol/L)响应的紫外-可见光谱(a)和荧光光谱(b)(插图是确定探针RCy7和Cu2+络合比的Job曲线，纵坐标对应的发射波长：577 nm)Fig.1 UV-Vis spectra(a) and fluorescence spectra(b) of RCy7(10 μmol/L) for Cu2+(0-100 μmol/L)(Inset:Job’s plot for RCy7.Emission wavelength:577 nm)

2 结果与讨论

2.1 光谱分析

为了研究探针RCy7对Cu2+传感性能，在体积比为1∶1的乙腈/Tris-HCl(20 mmol/L，pH=7.2)缓冲溶液中，进行了紫外-可见光谱滴定和荧光滴定实验(图1)。由图1(a)可见，随着Cu2+的不断加入，探针RCy7在633 nm处的强吸收峰逐渐减弱，并且在516 nm附近出现了一个新的弱吸收峰，吸收峰蓝移达119 nm。由图1(b)所示，自由探针RCy7的最大荧光发射峰是722 nm，这是Cy7染料的特征发射峰。随着Cu2+浓度的逐渐增大，探针RCy7在722 nm处荧光强度不断减小，577 nm处荧光强度不断增大，最大发射峰蓝移145 nm，因此，该探针可以实现有效地近红外比率检测，提高检测准确度。发射光谱蓝移是由于Cu2+诱导罗丹明酰胺环开环，同时伴随着从Cy7染料到Cu2+络合中心的光诱导电子转移(PET)引起的[15]。探针RCy7对Cu2+响应机理如图2所示。在577 nm和722 nm处荧光强度的比率(I577/I722)增大了近60倍。Cu2+的浓度在0～1.0×10-5mol/L范围内与探针荧光发射强度比率(I577/I722)呈良好线性关系，线性回归方程为：y=0.45x+0.04，相关系数R2=0.9928，Cu2+检出限为1.09×10-8mol/L。上述结果表明，探针RCy7可以比率检测此范围内Cu2+的含量，灵敏度高。此外，利用Job’s plot方法确定了RCy7和Cu2+的络合比为1∶1，见图1(b)插图，高分辨质谱(HRMS)也证实了这一结果，[RCy7+Cu]2+的计算值：1 306.7219；实测值：1 306.7253。

图2 探针RCy7对Cu2+的响应机理Fig.2 The responding mechanism of the probe RCy7 toward Cu2+

2.2 探针RCy7对金属离子的选择性

通过吸收光谱和荧光光谱研究了在体积比为1∶1的乙腈/Tris-HCl(20 mmol/L，pH=7.2)缓冲溶液中探针RCy7对不同金属离子的识别情况。由图3(a)可见，只有当加入5倍量的Cu2+后，RCy7在波长633 nm处的强吸收峰才消失，同时溶液颜色从蓝色变为淡红色。其他常见金属离子(Na+、Ba2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、K+、Co2+、Cd2+、Ni2+、Al3+、Ag+、Cr3+、Zn2+、Fe2+、Pb2+、Fe3+、Hg2+)都没有引起探针吸收光谱明显的变化。由图3(b)所示，只有当加入5倍量的Cu2+后，RCy7的荧光发射光谱才发生明显变化，最大发射峰从722 nm蓝移到577 nm，这和吸收光谱的变化相似，探针对相同量的其他金属离子不敏感。RCy7-Cu2+溶液在577 nm和722 nm处荧光强度的比率(I577/I722)为26.25，而RCy7仅为0.44。此外，一些活性氧、活性硫与氨基酸(H2O2、ONOO-、O2-、ClO-、H2S、Hcy、Cys、GSH)对Cu2+检测的干扰也很小。竞争性实验也证实常见的这些离子不干扰探针对Cu2+的特异性识别。结果表明，此探针近红外比率检测Cu2+具有良好的选择性。

图3 探针RCy7(10 μmol/L)对不同金属离子(50 μmol/L)的选择性Fig.3 Selectivity of probe RCy7(10 μmol/L) to different metal ions(50 μmol/L) (a) Absorption spectra;(b) Fluorescence spectra.

图4 pH对探针RCy7荧光强度比率(I577/I722)的影响Fig.4 Influence of pH on the fluorescent intensity ratio(I577/I722) of RCy7 (a) Free Probe RCy7(10 μmol/L);(b) Probe RCy7+Cu2+.[Cu2+]=50 μmol/L，Excitation at 550 nm.

2.3 pH的干扰

由于在生物体内检测Cu2+常会受到pH的干扰，故考察了不同pH体系中探针RCy7的荧光性能。如图4所示，不加Cu2+和加入50 μmol/L Cu2+时，在pH=5.5～11.3范围内pH对探针RCy7荧光光谱的影响都较小，但是加入Cu2+会引发比率信号明显增强，所以该探针可在生物体内于中性pH条件下检测Cu2+的浓度。

2.4 密度泛函理论(DFT)计算

通过Job’s plot和HRMS方法已经证实了RCy7和Cu2+的络合比是1∶1。为了进一步了解RCy7对Cu2+的络合机理，我们利用Gaussian 16[21]进行了DFT计算(图5)。图5a和5d是利用DFT优化的结构图，从图中可以看到，Cu2+和螺酰胺的氧原子和乙二胺中的一个氮原子键合，使得罗丹明螺酰胺环打开，从而导致罗丹明母体荧光增强；而从Cy7染料到Cu2+络合中心的PET引起Cy7染料荧光减弱。计算得到RCy7和RCy7-Cu2+的HOMO-LUMO能隙分别是2.28 eV与1.23 eV，因此RCy7和Cu2+的络合在能量上是有利的[22]。

图5 利用DFT计算的优化结构图：RCy7-Cu2+(a),RCy7(d)。碳、氮、氧和铜原子分别用灰色、蓝色、红色、砖红色表示。(b,e) HOMO轨道图。(c,f) LUMO轨道图。Fig.5 DFT optimized structure of RCy7-Cu2+(a) and RCy7(d).The carbon,nitrogen,oxygen and copper atoms are colored in gray,blue,red and brick-red,respectively.(b,e) HOMO orbital plots.(c,f) LUMO orbital plots.

2.5 RCy7的细胞成像应用

为了确定RCy7在生物体系中的应用价值，我们做了在HeLa细胞内Cu2+的激光共聚焦荧光显微成像实验(图6)。没有加入Cu2+的情况下，在HeLa细胞中可看到探针RCy7中菁染料发射的荧光(680～800 nm)。加入Cu2+孵化60 min后，可以看到HeLa细胞中罗丹明染料发射的强荧光(560～650 nm)，同时菁染料的荧光猝灭。结果证明，RCy7能渗透细胞膜，可以用于检测活HeLa细胞中的Cu2+。

图6 HeLa细胞激光共聚焦荧光成像。(A)用RCy7(10 μmol/L)孵育(a～e);(B)用RCy7(10 μmol/L)孵育过的细胞，再用Cu2+(50 μmol/L)孵育(f～j)。(a,f)：560～650 nm成像通道；(b,g)：680～800 nm成像通道；c和h分别是a和f的明场；d是a和c的叠加图；e是b和c的叠加图；i是f和h的叠加图；j是g和h的叠加图；激发波长：552 nm。比例尺：25 μm。Fig.6 Confocal fluorescence images of cells.(A) after treating with 10 μmol/L of RCy7(a-e);(B) after adding 50 μmol/L of Cu2+ to the cells treated by RCy7(f-j).(a,f) Image in the channel(560-650 nm);(b,g) image in the channel(680-800 nm);(c,h) bright-field image of panels a and f;(d) merged image of panels a and c;(e) merged image of panels b and c;(i) merged image of panels f and h;(j) merged image of panels g and h.Both channels are excitated at 552 nm.Scale bar:25 μm.

3 结论

我们设计并合成了一种新型近红外比率Cu2+荧光探针。在探针RCy7溶液中加入Cu2+后，Cu2+会引发探针最大荧光发射峰蓝移，从而实现了近红外比率检测Cu2+。检测Cu2+的灵敏度高、选择性好，检出限为1.09×10-8mol/L。在中性水溶液中探针对pH不敏感。更重要的是探针在活HeLa细胞中对Cu2+的激光共聚焦荧光成像，证明其具有一定的生物应用价值。